[求救] IF染integrin beta-1 問題求救

[altheacat (althea)]

各位強大的板友好~

實驗室想要看材料上面的coating層對於

mesenchymal stem cell 貼附會造成甚麼樣的影響，

因此有一部分的實驗是利用免疫螢光染色觀察

與focal adhesion 相關的protein 表現，

其中integrin β-1我試了許多條件

染完後在顯微鏡下觀察都發現訊號非常的弱，幾乎看不太到，

另外integrin的表現位置應該要在細胞膜上，

但我染出來是連整個cytosol都有看到，

不知道有沒有大大染過相同的蛋白，

因此在這邊想向大家求救，以下是我的實驗條件:


1. Cell 培養於玻片上4小時候觀察 (染色前有以光學顯微鏡確認細胞玻片上狀況)
2. 4% paraformaldehyde (in PBS), RT, 15mins
3. 0.3% Triton x-100, RT, 10mins,
4. 5% goat serum, blocking for 1 hour, at RT
5. 1st Ab, 稀釋比例-1:500, (4℃, 18hr; RT, 1.5hr and 37℃ 1hr 共三個條件)
6. 2nd Ab,稀釋比例-1:100 RT, 1hr

1st Ab: Mouse monoclonal [12G10] to integrin beta 1(abcam, ab30394)
2nd Ab: Goat anti-mouse IgG (H&L)-FITC (CHEMICON, AP124F)

先謝謝大家了!!!! (鞠躬)







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推 jabari: 沒染過 可是他在膜上 要不要試試不加triton??
→ altheacat: 恩~ 也有考慮過是不是因為是穿膜蛋白的關係
→ altheacat: 所以，Triton-X 100 會影響到實驗的結果
→ altheacat: 所以，上面的染色條件都有試過不加Triton X100
→ altheacat: 但是，結果跟有加的一樣><
→ altheacat: 而且一樣在膜內也可以看到綠色的訊號
→ milkpa: 一抗二抗的稀釋比例對調看看
→ Ianthegood: 2nd 稀釋到1000倍 多wash幾次
推 APPswe: 請問是人類細胞嗎?
→ altheacat: 是喔!! 細胞是human mesenchymal stem cell from bone
→ altheacat: marrow
推 isntangel: 用別的東西固定！如果細胞沒破應該不會染到裡面吧？！