Re: [方法]請問WB的band要怎樣壓片讓他看起來比較圓?

[t123401221 (沉默玩具)]

※ 引述《t123401221 (沉默玩具)》之銘言：
: 請問各位先進
: 我要看大約38KDa的分子GAPDH
: 跑12.5% SDS-PAGE 電壓80 V
: 但transfer完膜染ponceau S都可以看到明顯的band
: 接著就是接抗體1抗1:1000 o/n 二抗1:12000 室溫1小時
: 但是手洗壓片,壓個五分鐘
: 壓出來的band都很弱而且band都扁扁的
: 而且band跟band之間都沒有間距看起來好像都連在一起
: 可以麻煩各位幫我解決這個問題嗎??
: 謝謝各位^^


各位,我第一次貼圖如有不對的地方敬請見諒唷^^

http://ppt.cc/lZdl
這是GAPDH 一抗1:1000
可以請各位幫我解決這問題嗎?
謝謝大家^^

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※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1420597561.A.B51.html
推 ko363630: 感覺定量不太準確,而且用到1:1000還這麼淡.不是量太少
→ ko363630: 就是抗體太爛了,transfer membrance也有差
→ t123401221: 請問該怎麼改善定量問題阿?我的protein OD 595nm
→ t123401221: 測出來都差沒多少耶??
→ t123401221: 各位transfer條件都是甚麼呢?我方法100V 1hr transfer
→ dream903: 如果地量差不多也有可能是loading的問題，看你loading
→ t123401221: buffer裡有SDS之後再換成30V 30min buffer 裡無SDS
→ dream903: (定量)  loading太多可能會從well跑掉
→ t123401221: 我loading量都很少耶最多就9ul
→ dream903: 若是兩側的band較淡可能是transfer(濕式)時兩邊沒夾緊
→ dream903: 看起來band有點糊糊的，建議下膠製膠時凝久一點
→ dream903: 不然就是你的Tris buffer pH值跑掉了，要校正
→ t123401221: 但我家助理跟我用一樣的條件RUN出來的就很正常
推 ljii: transfer伏特數好像高了點 我習慣35V 90分 或50V70分
→ t123401221: 雖然我們兩個的細胞跟實驗都不同只有WB實驗條件一樣
→ ljii: 另外要不就是你loading定量沒定好就是你膠有問題,不均勻
→ t123401221: ljii 你的transfer裡有SDS嗎??
推 ko363630: transfer 我都用400mv 90min.transfer buffer我習慣會加
→ ko363630: sds,可以幫助他更容易transfer過去
推 ljii: 沒有SDS
→ ljii: 不過這很難參考. transfer條件跟你的gel, membrane, transfe
→ ljii: 系統有關, 不能一概而論, 要自己抓條件
→ ljii: 100V以我們lab常用的gel通常就會過熱, 所以我猜你的gel跟我
→ blence: 樓上用35V 90分 或50V70分很像semi-dry條件,與原po不同
推 ko363630: 對 我的是hofer系統,伏特高.所以我都會放冰箱
→ roy047: 定量, loading膠前必先vortex, spin down才不會吸不均勻
→ roy047: 或定錯量
→ t123401221: 謝謝各位的指教！
→ t123401221: 另外想請教各位有沒有推薦的method paper或是書可以
→ t123401221: 讓我參考呢?謝謝各位^^
推 ko363630: CURRENT PROTOCOL?
→ t123401221: 請問roy047定量,loading膠前是先vortex還是spin down?
→ roy047: sample先vortex確保混勻之後spin down 吸取
→ roy047: 因vortex完有些會在管壁上
→ roy047: 因為如果不均勻, 吸的protein量就時多時少了, 會造成誤差
推 ljii: 記得剛學western時loading一直有問題. 後來發現煮完沒有spin
→ ljii: down, 或是loading時太大力反濺出well, 這些都會影響
推 pent: 該不會是antibody搖不均勻的關係吧？
→ zoe77101y: 樓上……它濃度這麼高！很難哦！