→ blence:你忽略zebrafish這個了,不然以上的說法原po應該很有收穫 06/29 19:02
對耶......
因為我之前是做老鼠，
所以文獻很多，
Zebrafish 的確不止文獻少，
也沒有合適的 cell line 可以驗證表現強度......
※ 編輯: xxtomnyxx (42.76.97.161), 06/29/2014 19:29:36
推 kuochuwon:先感謝回應這麼詳細的文~ 07/01 00:00
推 kuochuwon:請問您提到在注射螢光到斑馬魚時,還要在另外注射一組到 07/01 00:07
→ kuochuwon:不表現sox2 (knock down?)的斑馬魚,為什麼不能直接取2組 07/01 00:08
→ kuochuwon:1組WT打螢光 1組WT不打螢光就好呢? 這樣做有什麼用意 07/01 00:09
→ blence:用有無sox2上游的KD(而非sox2 KD)是要瞭解上游基因有無影響 07/01 00:31
→ blence:如果只是分有無打螢光,那就是探討打不打這件事,有無影響 07/01 00:34
推 kuochuwon:了解了! 07/01 00:52
推 silverberry:可以藉這個標題請教一下，我用 paper 找到的 mouse 07/09 10:36
→ silverberry:promoter 序列比較 rat 和 human 相同的基因上游區域 07/09 10:36
→ silverberry:結果序列相似度大約只有 40-50% 左右。 07/09 10:37
→ silverberry:請問這樣值得一試嗎? 07/09 10:37
→ silverberry:我要測試的物種是 chinese hamster，相似度也只有 50% 07/09 10:39
→ silverberry:也是沒有合適的 cell line 可以驗證表現強度.... 07/09 10:40
我不太清楚你是怎麼比對序列的，
但是如果我的理解沒錯，
我不會拿已證明的 mouse promoter 序列去跟 rat 和 human 的「上游序列」比對，
我會直接在 NCBI 的 BLAST 中選擇 rat 或 human，
然後拿那段序列去做 BLAST，
找整個 rat 或 human 的序列中與這段 mouse promoter 最相似的序列。
我曾經做過一個案例，
某基因在一個物種 A 以 TSS 為準 -1000 ~ +1 的序列，
在另一個物種 B 上這段序列卻是在 TSS 為準 -4000 ~ -3000 的位置，
但是那段序列相似度非常高，
而兩種物種該基因的一大差別是 A 的 mRNA 有一段 2 kb 左右的 intron，
而後者沒有。
圖解：
物種 A TSS
┌→
DNA －┼－－－－┼－－－－┼－－－－┼－－－－→
RNA ＝…………………………＝＝＝＝→
↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑
｜｜｜｜｜ ＤＮＡ序列高度相似 ｜｜｜｜｜｜
↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓
物種 B TSS
┌→
DNA －┼－－－－┼－－－－┼－－－－┼－－－－→
RNA ＝＝＝＝→
＝ Exon
… Intron
這種情況下，
Enhancer 的序列有可能是在物種 A 的 TSS 前，
也有可能是在物種 A 的那段 intron 中，
因為我這個案例的基因並沒有 promoter 序列的相關文獻，
所以真的要測試就要兩段序列都拿來測，
當時我手上還有其他有文獻的基因的 promoter 要做，
所以這個案例就被我放置了 XD
呃....扯遠了，
總之我要說的是，
不要把 promoter 序列限定在 TSS 上游的固定範圍內，
有些 paper 證明的 promoter 可能同時包含 promoter 和 enhancer，
Enhancer 的位置不像 promoter 是固定在 TSS 附近，
有可能會在離 TSS 很遠的位置，
所以要從整個 DNA 的序列中去做 BLAST，
通常只會跑出一個高度相似的結果，
那個結果就應該會是你要的 promoter 序列了。
然後，
我隨便拿了 mouse hoxb9 的 上游 350 bp 的序列
去跟 human 還有你的 Chinese hamster 做 BLAST，
Human 有找到整個序列 350 bp 都有 91% 的辨識度的序列，
位置也是在 human 的 HOXB9 附近，
Chinese hamster 則只有 200 bp 左右的序列有相符，
但是那 200 bp 序列的辨識率也有 98%，
我想 Chinese hamster 的 genomic DNA 應該還沒完成定序吧？
少掉的那 150 bp 大概是因為沒有資料所以沒辦法比對。
有錯還請指正
推 chaunen:shsy5y(human)有表現sox2 也容易transfection 試試看嗎? 07/12 22:08
→ chaunen:針對conserve 的片段下手吧~ 07/12 22:09
※ 編輯: xxtomnyxx (42.70.58.194), 07/12/2014 23:51:18
推 pandagod:專業熱心推 ! 07/16 00:11