Re: [閒聊] mammalian cell lysis

[iMed (so sad)]

※ 引述《blence (        )》之銘言：
:   標題用閒聊，是想幫別人詢問一個看法
:   以我的瞭解，從culture dish收lysate有兩種不同的習慣
:   一種是先加入PBS後，將細胞收集到eppendoff，之後才lyse
:   由於我是習慣用第一種方法
:   而另一種是PBS洗後，直接lyse on dish
:   想請問如果是後面那種，對於35或60mm dish會建議lysis buffer至少多少量才適合？
:   或假如使用100ul，通常回收的體積會偏高或偏低？
:   如果變低還可以當作buffer lose而不去管
:   遇到體積變高會不會覺得怪怪的？

我是用第2種方法  通常回收的體積都會變多
我的推測是:
1.PBS洗後沒有移除乾淨
2.冰上跟室溫的溫差太大  造成水氣的凝結

因為我把PBS移除後，通常會把dish傾斜於冰上，等3-5分鐘
就還可以吸到少量從壁上慢慢流下來的PBS
偏高的情形就能改善

至於lysis buffer量的問題我是參考abcam的western blot protocol

1 ml per 10^7 cells/100 mm dish/150 cm^2 flask;
0.5 ml per 5x10^6 cells/60 mm dish/75 cm^2 flask

不過有時會發生藥物處理組高濃度的部分收到的lysate太稀
導致一個well loading不了那麼多sample的情形@@
可是實驗室又沒有特殊的離心管或之前一位神版友分享的特殊濾膜可以離心
希望有版友能解救一下

另外想藉著這個主題問一下
請問大家lysis後會再用超音波震碎嗎？
我有震的話  高速離心後收的的碎片較集中 呈深褐色
沒有震的話  碎片的上方總是會多一點白白稠稠的東西@@ 不知道那個要不要收？

希望版友也能分享一下
謝謝^^




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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1421101255.A.BBC.html
推 gps0110: 我做wb會用urea sds 收 可以用很小的volume
推 gps0110: 不過用urea收不太好定量就是了
推 gps0110: 白白稠稠的應該是 genomic DNA 除了sonication可以加點DN
→ gps0110: ASE
→ blence: 高速離心後的cell debirs會呈現深褐色？
→ iMed: 嗯嗯  我收下來的是這樣 算是土黃色吧@@    謝謝gps的解答
推 chaunen: 深色dibris應該是震到焦掉了 之前震gDNA 做ChIP也是這樣.
→ chaunen: 不過我的細胞lysis&離心完都會有像lipid的白色渣浮在上面
→ chaunen: 稍為votex一下 液體就變得混濁 bradford或BCA定量就不準
→ chaunen: 有人遇過嗎Q_Q"