作者vantis (凡提斯之貓)
看板Biotech
標題[討論] akaline phosphatase activity assay
時間Thu Jan 22 16:05:46 2015
大家好!
小第的老闆想要探討osteogenic differentiation
最近打算購買Alkaline Phosphatase Assay Kit (Colorimetric),Abcam
但該組kit沒有提到關於cell sample前處理方法
目前參考一些protocol跟paper,想請問板上的各位神人,下面設計的前處理方式是否ok?
1.wash monolayer cell in 24 well(1*10^4/well) with PBS twice
2.add 300ul 1% triton X-100 in PBS (lysis buffer)
3.scrapping cell and incubation on ice for 1.5 hr
4.2000g, 15min, 4℃ centrifugation
5.測定supernatant protein concentration
6.依Kit說明書測定Alkaline Phosphatase含量
另外還有一些關於此實驗的疑問
有些paper中有看到加了lysis buffer(0.1~0.2% triton X-100),會冷凍解凍三次
如果我用1% triton X-100還需要冷凍解凍嗎?
另外關於sample normalize有點疑惑,請問是測定total protein濃度後,
以lysis buffer將sample調整到相同濃度並取等量進行酵素活性測定(類似WB的定量方式)?
還是無須調整sample直接取等量跑完酵素活性測定後,再和total protein濃度相除?
麻煩各位協助了!
謝謝!
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→ blence: 網頁protocol有寫,kit也有附assay buffer讓你處理sample喔 01/22 17:01
→ vantis: 眼殘@@!謝謝喔! 01/23 05:48
→ vantis: 那請問加了assay buffer要作用多久才會lyse完全? 01/23 05:51
→ vantis: 之後要做total protein定量並依所需量(ug)加入檢體 01/23 07:53
→ vantis: 再用assay buffer將體積補到80ul嗎? 01/23 07:53
推 Misher: ...好麻煩，我用 sigma 的直接測就行，不用打破細胞。 01/23 23:01
→ Misher: 用Mtt 校正 01/23 23:01
推 Misher: 你那應該是先測酵素活性，再除蛋白量校正吧！ 01/23 23:02
→ Misher: 8?lang=en®ion=TW 01/23 23:05
→ Misher: 我用這個，參考看看。。 01/23 23:05