[閒聊] Genome editing - CRISPR/Cas9

[silverberry (平行線上的交集....)]

大家好，標題用閒聊是想聽聽大家的意見。
如果不合適的話請告訴我，我會修改 m(_  _)m

我的實驗室最近想要開始使用 CRISPRC/Cas9，
除了從 addgene 買了相對應的 vector，
為了快速地確認這個技術在實驗室是成功的，
我們決定先把有 stable eGFP transfect 的細胞裡的 eGFP 做 deletion。

根據 gRNA 設計的原理，
最後挑了四個 gRNA


         gRNA1                    gRNA2
     5'-nnnnnnnnnn 我是 eGFP nnnnnnnnnnn-3'
     3'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5'
          gRNA3                     gRNA4

gRNA1,2 是根據 (+) strain 設計的
gRNA3,4 是根據 (-) strain 設計的

為了確定可以把 eGFP 去掉，
除了一定要的 Cas9 以外，
打算做 gRNA1+gRNA2
       gRNA1+gRNA4
       gRNA3+gRNA2
       gRNA3+gRNA4   四組 co-transfection

然後再看看哪一組都不亮了、並配合 FACS 跟 genomic DNA PCR 確定真的成功了。


設計這四組 co-transfection，合理嗎?

還是我們想太多了?


雖然很可能試了才知道怎麼會成功，

不知道有沒有人可以分享一些經驗^^



謝謝 m(_  _)m


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→ williamyang: 我的做法是先確認單獨的會切,再做送一對的
→ williamyang: 至少目前都沒失敗過
→ williamyang: 還有你的cell line要選合適的,HeLa不是適合的
→ silverberry: 單獨的會切，也是送 cell 裡嗎? 這樣要怎麼確認有切?
→ silverberry: 目前是做 CHO cell，之後可能會做 hES or mES
→ williamyang: http://ppt.cc/D4we 我是照這protocol的做法
推 williamyang: knockout and knockin都是working的
→ silverberry: 請問是多大的 knockin? 我希望未來可以把 GFP
→ silverberry: 放到 target gene 的後面做 reporter
→ silverberry: 還是我先 knockin loxp 之類的序列 比較適合?