推 silverberry: 關於 eGFP 的 copy number，我們已經確認過只有一個 01/24 11:05
→ silverberry: copy，所以才想說用這個方法測試。 01/24 11:05
→ silverberry: 不過 indel 3n 這個問題的確有點麻煩，我會注意。 01/24 11:06
→ silverberry: 我會看一下 T7E1 這個方法，感謝您的建議^^ 01/24 11:06
※ 引述《silverberry (平行線上的交集....)》之銘言：
: 大家好，標題用閒聊是想聽聽大家的意見。
: 如果不合適的話請告訴我，我會修改 m(_ _)m
: 我的實驗室最近想要開始使用 CRISPRC/Cas9，
: 除了從 addgene 買了相對應的 vector，
: 為了快速地確認這個技術在實驗室是成功的，
: 我們決定先把有 stable eGFP transfect 的細胞裡的 eGFP 做 deletion。
: 根據 gRNA 設計的原理，
: 最後挑了四個 gRNA
: gRNA1 gRNA2
: 5'-nnnnnnnnnn 我是 eGFP nnnnnnnnnnn-3'
: 3'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-5'
: gRNA3 gRNA4
: gRNA1,2 是根據 (+) strain 設計的
: gRNA3,4 是根據 (-) strain 設計的
: 為了確定可以把 eGFP 去掉，
: 除了一定要的 Cas9 以外，
: 打算做 gRNA1+gRNA2
: gRNA1+gRNA4
: gRNA3+gRNA2
: gRNA3+gRNA4 四組 co-transfection
: 然後再看看哪一組都不亮了、並配合 FACS 跟 genomic DNA PCR 確定真的成功了。
: 設計這四組 co-transfection，合理嗎?
: 還是我們想太多了?
: 雖然很可能試了才知道怎麼會成功，
: 不知道有沒有人可以分享一些經驗^^
: 謝謝 m(_ _)m
首先，利用Cas9破壞EGFP表現的原理是造成insersion or deletion
然後讓EGFP序列發生frameshift，破壞正常胺基酸序列
但有時候Cas9造成的insersion or deletion恰好是3n，所以inframe的結果是EGFP繼續亮
其次，因為是transient表現的細胞，所以plasmid在細胞的copy number比較多
就算Cas9逃過了第一點，也很可能因為只切了30%的plasmid，所以EGFP繼續亮
所以，我擔心你的實驗設計無法告訴你太多資訊
比較好的做法是找一個endogenous gene
利用T7E1 assay確定efficiency就好
這樣才有機會比較快知道這套系統能不能在貴實驗室作用
我自己是用這個方法進行，也沒有什麽太大的問題
比較多的經驗是做成conditional KO mice及point mutation KI mice
如果大家有興趣，我們可以再討論
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