[求救] Insoluble蛋白純化urea回溶不佳

[lyu0001 (鄉民1號)]

純化一個不溶性蛋白，破菌後溶於lysis buffer，離心後，
再把pellet回溶於含6M urea的lysis buffer，
結果發現回溶於urea的蛋白只有20～30％。Orz

不確定是不是導致蛋白質純化量很少的主要原因。

請問怎麼增加不溶性蛋白的溶解度？
有建議的方法嗎？

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 123.192.204.190
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推 jabari: 8m 16m催下去
推 Ianthegood: 7m urea +2m thiourea
一般條件是用8M urea，如果有雙硫鍵，要加還原劑打斷-s-s-
可能先試試看8M urea + DTT condition
※ 編輯: lyu0001 (123.192.204.190), 01/24/2015 11:28:38
推 Ianthegood: 7m urea+2m thiourea是跑2DE最常用的cond.
→ Ianthegood: 有thio基可以溶一些urea無法處理的官能基
發現問題應該出在elution pH要在5.6 or 4.5   pH7.4可能不適用...
Urea 6M改成8M 應該可以增加溶解度

更新：溶解度是改善了，但是protein binding還是很弱 Orz
flow through很多沒有binding上去
※ 編輯: lyu0001 (123.192.204.190), 01/27/2015 18:59:01
推 jabari: 我覺得你表現大量再切膠回溶可能都還比較多@_@
→ Ianthegood: 7M u+ 2M thu, freeze&thaw 1x,sonication in wet ice
推 kg9101266: protein induction的溫度是?會不會變成inclusion body?