[求救] western blot很奇怪的髒法

[martinyang13 (楊熊)]

各位先進好

我們研究室最近才剛成立分生的部分 所以很多東西都還在嘗試

最近在抓L牌的半乾式轉印 i○lot2 以及後續接抗體時遇到了很多問題

像是常見的大分子轉不夠 小分子全跳海

或是marker都轉過去 sample還留了一半多在膠上 (用coomassie blue染過)

甚至GAPDH的轉漬靠邊緣的band會呈現三角形這種不均勻的狀態

不知是否有先進已經掌握這台的特性能夠指點一二



以下是主要問題

最近在冷光呈色時發現會有如下圖的直向污漬

http://i.imgur.com/CAlF1Nh.jpg
http://i.imgur.com/cI8MMnR.jpg

由於跑膠本身也是使用L牌的gradient gel 及其電泳槽

轉漬也是用他的stack跟program

之後

剪膜
T牌的TBST blocking buffer 1hr
TBST wash 15min*3
一抗 4度 overnight
TBST wash 15min*3
二抗 1hr
TBST wash 15min*3

wash大力搖 接抗體輕輕搖


其他蛋白都沒有相似現象 唯有collagen I 會出現這樣的直向污漬

不解的地方在於為什麼會是直向的? 如果是blocking出錯應該是整片髒

抗體有問題的話也應該是整片亂接

而這邊感覺又像是有點規律 不知是否有前輩遇過相似的情況?



*使用MG63及hpulp兩種人類細胞

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.34.108.149
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1422370397.A.AF0.html
推 lail: 直接找廠商作trouble shooting?
推 abcam: T牌 如此大……不就是 要他的 service嗎？
T牌這部分只買了blocking buffer 其他都是L牌的

可是我們這邊的L牌業務很...(略

問他也只會說他其他客人都沒問題

目前正在想辦法減低跟他的往來這樣

T牌業務很盡責每天都來 不過好像問題不在他身上

→ blence: 這支collagen I抗體應該是rabbit的,而且可能是放4度C的？
→ blence: 這些廠商併來併去,我都猜不出文章寫的是什麼廠牌..
→ blence: 修正,剛看一下mouse的也會,而且都放4度C的
正是如此 所以樓上也有過類似經驗?
※ 編輯: martinyang13 (114.34.108.149), 01/28/2015 00:49:25
→ williamyang: 是有純化過的抗體嗎?若是anti serum這很常出現
是純化的

推 supray: 溶解度不佳的蛋白有時也會這樣  可以稀釋再跑看看
但是我們用coomassie blue染轉漬後的膠上並沒有出現這樣的拖曳痕而是清楚的band

也有直接染過未轉漬的膠 同樣也是條條分明

圖中的拖曳痕甚至比band還亮 不太可能coomassie blue染不到吧?
※ 編輯: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 10:07:24
→ blence: 同意,是純化的,純化的才能放4度,anti-serum的髒不像這樣
推 silverberry: 請問是 PVDF or NC? 有用 Ponceau S 染轉好的膜嗎?
stack裡面的 應該是PVDF膜吧

有 膜上也是band很清楚  沒有這種直條的
未轉漬的膠
http://i.imgur.com/2M9Vg2I.jpg
用P0轉的膜
http://i.imgur.com/ld9Kr4y.jpg
※ 編輯: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 15:46:00