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標題: [求救] QPCR primer設計及PCR檢測 時間: Thu Jan 29 12:19:48 2015 事情是這樣的 把之前學長設計的 QPCR primer 拿去跑 PCR (以cDNA作為模板) 結果發現有些 primer 的夾出的基因片段很模糊, 有 dimer 或是夾不出來目標片段 老師希望我重新設計引子對,而學長當初是以老師給他的序列 (200-500bp)(早期片段,來源 不明) 來設計引子 因為之後可能會進行 RNAi 的實驗, 所以可能需要更長的片段 所以我就拿之前老師給學長的序列拿去 NCBI 做 Blastn 對應到的第一名的序列 Query cover, identity 趴數都很高, 而 E-value 也都很趨近於 0,物種相同,片段長度都有 1000bp 以上 將這些序列送至 Primer Expression 軟體進行引子設計(Tm值設定為 58-60度C, primer 長度為 9-40bp,GC content為 30-80%...etc) 跑出來的 primer 有五十名, 但因為前面名次的 primer 會有hairpin, dimer 或 cross dimer, 所以我會往下挑選 可是最後跑出的卻夾到許多非目標的大片斷或不明顯 下圖為 PCR 膠圖結果 http://imgur.com/IQYc9sm 第一個 well 是 housekeeping gene 做對照的 其他的為我設計的基因 primer, 一個基因 load 兩個well 第一行字為基因名稱, 第二個為 annealing 溫度, 最底下那排為預期長度片段 跑出來好糟糕QQ 還是真的是我太雖 挑到的primer都很差... 懇請版上大大指教與挑錯plz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.189 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1422505191.A.72E.html ※ 編輯: zodiac123 (140.112.4.189), 01/29/2015 12:20:36
→ blence: 其實不算很糟糕,其實文章第三句用QPCR primer的片段很模糊 01/29 13:22
→ blence: 就猜想你應該忽略band的清晰度取決於膠的濃度與片段大小 01/29 13:25
→ zodiac123: 忘了說明我使用的是2% TAE 可是做對照的基因都很明顯 01/29 13:32
※ 編輯: zodiac123 (140.112.4.189), 01/29/2015 13:33:35
推 jabari: 建議啦.長度過300就不要了 exon-exon的話1-200就好了 01/29 13:48
推 jabari: 再來不不知未來你一盤要跑幾個基因 不過pcr階作個gradient 01/29 13:49
→ jabari: 比較能清楚哪個primer比較好用 建議都跑一次找個最佳化 01/29 13:50
→ jabari: 最後一點 你這gene只有一個transcript??量?? 01/29 13:51
推 jabari: 因為你放的b-tub 我覺得光看semi qPCR的感覺..他的量好像 01/29 13:54
→ jabari: 沒有很高耶Q_Q 是用induce後回收再轉的cDNA嗎? 01/29 13:54
→ jabari: 不過我覺得最後一個還不錯啊@_@? 01/29 13:55
→ zodiac123: 最後一個可能是唯一可以忍受的...我要被老師罵慘了QQ 01/29 14:33
→ zodiac123: cDNA是直接以活體抽RNA後RT 01/29 14:34
→ zodiac123: 之後我還會再提高annealing溫度跑一次 01/29 14:35
→ zodiac123: 到底為何會夾到大片段QQQQQ 01/29 14:39
推 jabari: 跟pcr和pol有關啊.好的pol 72度跑個20秒就一堆500bp以上了 01/29 15:35
推 supray: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 01/29 20:10
→ supray: 用primer blast確認一下會不會p到其他東西 01/29 20:11
→ supray: 如果你的物種不會太罕見的話 01/29 20:12
推 as862437: 感覺你大片段非專一黏合的比目標多，不夠專一? 01/29 21:26
推 supray: 等等 預期長度片段只有60bp? 01/30 08:45
→ supray: amplicon我會挑100bp上下 讓它跟primer dimer比較好區分 01/30 08:51
推 Mistletoe921: 上面講的都對,如果接下來要做qPCR,你的Tm直接抓65度 01/30 16:41
→ Mistletoe921: 上下,50~60度那是一般PCR再用的.如果要用PCR確認引 01/30 16:43
→ Mistletoe921: 子是否能用,Taq別用HiFi的會做出亂七八糟的東西 01/30 16:47
→ Mistletoe921: 你的PCR產物那麼短,跑的膠改用4%吧,ladder看有沒有 01/30 16:49
→ Mistletoe921: 50bp或25bp的能用,100的實在看不出來. 01/30 16:50
→ Mistletoe921: 最後既然primer都合出來了,乾脆直接上qPCR跑一個樣 01/30 16:51
→ Mistletoe921: 本,然後看anneling curve最快惹~ 01/30 16:52
→ Mistletoe921: 另外,primer設計的部分我會習慣3'用G或C結束 01/30 16:59
推 rodmen: 原Po 鳥松 吳尊推 01/30 17:08
推 jabari: 長度那麼小 用qpcr機器跑個melting比較快 01/30 17:32
→ zodiac123: 謝謝各位大大的回答 有結果再回報給大家 01/31 15:12