[求救] 有關PCR的問題

[polomi (polomi)]

版上大家好~

小弟目前正在進行有關E. colo同源重組的實驗，

最終的確認是使用PCR判斷有無成功的插入到genomic DNA上。

如果是失敗的會保留原長度約為1.1KB，

成功的話會改變其長度。

PCR都是使用相同的primer跟相同的溫度條件設定。

萃取完DNA後，

也有使用DNA clean kit做純化的動作。

有測量OD260/280算濃度。

每管每次PCR添加的genomic DNA template都固定約為200~300ng。

使用的polymerase為 ACCU DNA polymerase。

http://www.yeastern.com/Products.php?pid=169&pkid=10&pttype=60

按照原廠建議使用。

primer最終濃度為0.2uM

dNTP 最終濃度為 0.1mM

每次都固定50ul

可是最近幾次的PCR都無法出現結果。

有使用先前成功的template做對照。

有附圖說明，請參考。

http://ppt.cc/to8T

均為同時跑PCR的結果。

PCR buffer是先除去template跟polymerase外先混合均勻，

再分別添加的。

各項溫度的設定並未改變。

請問我有哪裡需要再做改變的?

麻煩各位了

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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1423399817.A.4BE.html
→ scherzoinb: 直接拿菌去跑pcr，如有band，那就是gDNA萃取的問題，
→ scherzoinb: 如沒有band，那表示重訂primer~~~~~~
→ skybreeze: 或者跑一組house keeping gene的primer 測試gDNA
→ blence: house keeping gene?? 不知E coli是哪一個gene？
推 as862437: 16s 算嗎？
推 as862437: 之前粹的gDNA 也是有跟這次一起重新PCR跑嗎?如果有就不
→ as862437: 是primer 問題了，應該是萃取過程出問題