推 polomi: 謝謝您~~我已經跟經銷商聯絡 需要升級軟體才可以梯度PCR 02/14 13:21
→ polomi: 以及請問如果目標序列GC大約在57%會算很高嗎? 如何改善? 02/14 13:22
→ Ianthegood: 不算 02/14 14:53
腦補
默默的覺得你的vector可能有一個點換錯地方了XD
chromosome被重組
所以有抗性 但是p不出來
可以多用幾組primer交叉測試一下
或是看一下crossover的點有沒有辦法在genome裡面blast到其他東西
然後mycycler好像要升級才能用gradient
問問你們經銷商吧
※ 引述《licat (licat)》之銘言：
: ※ 引述《polomi (polomi)》之銘言：
: : 去除的片段長度約為450 bp，
: : 而使用插入取代的抗性片段約為1.6 KB。
: 那你原本設計用來確認重組狀況的primer，離置換位置有段距離
: 會讓PCR困難度變高，可以考慮設計得近一點
: (不過看你PCR的圖，這應該不是做不出來的主因)
: : 利用kanamycin 15ug/ml，
: : 互換的機制是同源重組交換的方式。
: : 有一個大陸的網站寫得滿淺顯易懂的，
: : http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology
: : 主要的參考是這篇paper
: : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079
: 我用過這個系統，跟其他互換系統相比沒那麼順利
: 雖然看起來很簡單但不容易除錯，DNA電進去後都不知道出了啥事
: 如果你能找到用得很順的人，建議直接跟他請教
: 如果周圍沒有，而你又是作E. coli，我覺得你換用SacB系統做還比較好
: : 各加上目標取代位置前後各50bp送入。
: : 主要送入方式都是以電穿孔的方式。
: :
: : 因主要表現重組蛋白的質體為溫度敏感型，
: : 過程中都有注意培養的溫度是否有低於30度。
: : 那個我有取只含有重組蛋白質體的菌來pcr過，
: : 用原本的primer表現，
: : 的確原本的片段長度約為1KB左右。
: : 應該可以初步排除雜菌的可能性。
: 以上所述是無法排除的啦
: 但我猜那些菌落還是你的E. coli，而且有發生重組所以才有Km抗性，
: 然後你的PCR也才會變成作不出來
: 只是重組方式跟原本預期的不一樣...
: : 恩我用附圖的方式可以嗎?
: : http://ppt.cc/5iBm
: : 請原諒我必須刪掉我的目標序列名稱。
: :
: : 阿~~~
: : 希望不要阿。
: : 我連發票都是一整年頂多中一張200的機會啊 QAQ
: 這跟機率無關，你應該找有經驗的人幫你看一下整個互換設計跟引子位置是否正確
: :
: : 其實原先主要的annealing溫度為58度，
: : 現在有嘗試過，
: : 50 55 58 60 62 64，
: : 主要都是30秒。
: : 也有嘗試著加入DMSO，
: : 其結果如下圖:
: : http://ppt.cc/C99u
: : 感謝您，
: : 我會先嘗試著降低溫度試試看～
: 嗯...多了解後，我覺得改PCR條件的成功機率不高，但還是祝你好運
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