[求救] transfer後殘留在蠻多在膠上

[pent (有人試我的密碼，幹)]

濕式tranfer
buffer: Tris-glycine-methanol
Tris: 3.03g
glycine: 14.4g
methanol 200ml
補水到1L

10% SDS-PAGE, load 20ug protein

tranfer 條件：定30V 大約9x~11x mA, 16hr, 然後調到定60V, 29x mA 3hr
在4度C cold room

result:
http://ppt.cc/Bkex
PonceauS 可以看到100kDa以上高分子量的都看太不到
但我的western blotting不需要管那部分...
不過就是搞不懂為何會殘留這麼多...

http://ppt.cc/MvSB
commassie blue發現不管高低分子量都有殘留

我是抽membrane /cytosolic fraction
先用低張的tris磨和脹破組織細胞，然後用1% triton x-100,
十萬轉收membrane fraction

不過我的western blotting還是可以壓的到訊號...似乎也沒太大的影響
還是我該加個0.01% 的SDS到tranfer buffer中呢？

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.109.220.139
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※ 編輯: pent (140.109.220.139), 03/15/2015 00:11:50
→ blence: 我看不出condition有明顯問題,但覺得奇怪的是為何ponceau
→ blence: 上比marker還顯著的band,卻沒有在CHB上看到殘留?
→ blence: 修正,是"marker的band還比較顯著,卻..."
推 tynse71864: transfer時間好久喔@@
→ BGG: transfer 100v 1hr 4度，效果應該不錯
→ blence: 上面這個condition用在10%膠,150kda以上的很難不殘留
→ wang987: 為什麼要要run這麼久阿？有什麼原因嗎？
→ zoe77101y: 可能是想轉的效果好吧！試看看高電壓，短時間！
推 rubidus: 我都100~120V隨意 60~80min 5度
→ rubidus: transfer buffer加1ml SDS 10% 染CBR可以到只剩180kDa up
→ pent: 請問樓上，buffer裡有methanol嘛？