[求救] stable clone建立

[tynse71864 (TATA box)]

各位版友們好

老闆要求我在小鼠小腸上皮細胞的cell line中

用transfect方式來overexpress我要看的protein

老闆教的方法是:

1.transfect 24hr 後 分成6盤並加入puromycin 2ug/ml(已確定濃度殺的死

2.selection 約2周

3.直到可用肉眼從10cm plate 底下看到細胞團時

用3~4ul的trypsin 把該細胞團上下pipeting吸起來

轉移至24well 中 (這個細胞不容易長成一大坨疊起來  會聚成一片

所以pipet時蠻容易吸到旁邊的colony

4.養到6 well後 收lysate與做stock


此時的western結果都清楚的 會有一個很強的band




問題來了

當我重新thaw out這些cell stock時，會持續養在1ug/ml的puro-DMEM中

(老闆跟學長說可以

但養了幾代後 我的western表現量就越來越低了 之後就沒表現了...

於是做了limit dilution 終於拿到有表現的細胞(只有1個clone

而且目前養了2~3個月都沒有掉

做growth curve結果是  overexpress這個protein會讓細胞長的比較慢



由於只有一個clone 老闆希望可以duplicate

因此我又重新transfect 要挑stable clone

結果還是一樣....thaw out後養了幾代western就沒看到表現了

而且幾乎是0表現  所以limit dilution(正在做  但不太覺得養得出有表現的)



老闆一直覺得是我lysis buffer配錯導致protein lysis不出來

我從NP-40-->TX 100--> RIPA(NP40+DOC+SDS)一直換

他覺得我lysis buffer由於另外加了inhibtor

所以NP40濃度會從1%--->0.95%  導致protein lysis 不出來


而我自己是覺得 會不會我挑single colony時 本來就不是single來源

而且有表現蛋白的細胞又長比較慢 所以就慢慢被埋沒了


為了建立這個stable clone  半年都快過去了

看著同學的data一直生  自己卻一直卡在這裡  有點崩潰阿...

有沒有什麼挑stable clone的建議呢?

是該在最前面transfect後  直接做limit dilution

以確保clone是單一來源嗎? 還是有其他建議 謝謝QQ

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 123.194.138.71
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1427035407.A.713.html
推 tsubasawolfy: 如果那麼確定該蛋白oe會影響細胞生理 怎麼不改誘導
→ tsubasawolfy: 型表現呢
推 ararthur: 1%換成0.95%就會lyse不了...是不是你老闆在搞你啊
推 ararthur: protein lysate跑其他蛋白 例如internal ctrl呢 有嗎?
→ ararthur: 如果有那就不會是lysis不完全阿
→ ararthur: stable clone常常會跑掉 特別是凍了以後 我有做過transf
→ ararthur: -ect後凍起來就會死掉的細胞... 不行就建議密集把實驗做
→ ararthur: 完不要仰賴凍起來的stock吧
to T大：我有想過但沒跟老闆提  他應該會說：“沒這個必要吧？”

是說induced的有什麼好處嗎？
to A大:我的細胞STOCK後不會什麼死 (超會長)  但表現真的會大下降
因為實驗室只有我一個人在用這種細胞  所以問誰都不知道
我試試看細胞一直養到實驗做完吧 (前提老闆要同意...

另外internal ctrl很正常  我去lyse 之前LD挑出來的clone表現也正常
是新挑的都不表現了 所以我覺得不關lysis bfr的事...
但老闆就要我一直重跑western (ry
※ 編輯: tynse71864 (123.194.138.71), 03/23/2015 01:19:05
→ blence: 用lysis buffer的理由好像有點瞎?
→ blence: 如果要重挑,在puro接近穩定之後種到極稀釋,就不會難挑了
是puro篩個10天左右  繼續用原來的plate 種到很稀；  還是改種96well呢？
※ 編輯: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 11:25:14
推 tsubasawolfy: lysis buffer理由超瞎所以完全不想理
→ tsubasawolfy: 如果你要繼續挑的話看要不要增加一點puro的量
→ tsubasawolfy: 接著因為細胞特性的關係不要養到肉眼可見
→ tsubasawolfy: 顯微鏡下可看到一團形成時用glass cylinder挑
→ tsubasawolfy: 至於會不會碰到其他的colony...transfection後分稀
→ tsubasawolfy: 一點讓各colony距離大一點
※ 編輯: tynse71864 (42.66.40.126), 03/23/2015 16:14:10
→ Ice9: 若没有 glass cylinder，可以自已切 tip 的頭……另外，可以
→ Ice9: 削尖 tip 尖端用來挑起 colony。
推 yuyu219: 比較建議解凍後先用較高濃度的puro，穩定後再調低。如果
→ yuyu219: 繼續被老師懷疑lysis buffer，你就sonication給他看，不
→ yuyu219: 相信protein沒有出來 = =
to 塔芭莎大(?) 跟ice大: 這樣的話我應該就要在非hood下進行挑細胞了耶
這樣好嗎  (因為曾經長fungus過...)  我在想想有沒有折衷的辦法

其實會用固定濃度PURO去篩 其一是我之前測試過該濃度可殺死
其二是我拿到的Vector 建議transfect selection就是該濃度
所以我一直沒有去調puro 的濃度

我lysis細胞會vortex 5次耶XD  所以該出來的應該都出來了(吧
不然就是degrade光了...
※ 編輯: tynse71864 (123.194.138.71), 03/26/2015 23:13:45
→ Ice9: 不是肉眼可見嗎？ 在顯微鏡下先在dish背面點一下相對位置，
→ Ice9: 再回到 hood 中操作啊。
→ Ice9: 肉眼可見的 colony 中雖然可能還有一部分
→ Ice9: 可能含有還未死透的細胞，但比一開使用trypsin沖刷的強一點
→ zoe77101y: 跑看看PCR,會不會只有在基因上只有差異，蛋白不太明顯
→ zoe77101y: ！？