[求救] plaque assay 細胞會掉

[jenna2bb ()]

最近做plaque assay都會有此現象，不知道有沒有人知道是什麼問題
http://i.imgur.com/xcskVXQ.jpg
http://i.imgur.com/ccM88hI.jpg
連mock也是，但有些細胞沒掉的地方還是會有plaque
以下是protocol
1.前一天種MDCK 6x10^5至6well，隔天約8-9分滿做
2.隔天用冰E-0 DMEM稀釋病毒，10^-1~10^-7，插回冰上
3.PBS wash 兩次
4.各加500 ul mock及-3~-7稀釋的病毒，室溫15rpm 1 hr
5.PBS wash 兩次
6.加入配好的0.3%agar(+E0 DMEM)+2 ul/cc trypsin
7.放30-60分鐘凝固放回37℃培養
約50小時後就看出細胞掉了，有些地方有plaque
8.用10%福馬林固定，室溫o/n
9.沖掉，0.1%結晶紫染色

因為實驗室有人也有做，都不會有這個現象，應該不是細胞或病毒或plate有問題，希望
有厲害的人能幫助我，看看我是不是有地方沒注意到，謝謝!!


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.71.199.76
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1428543257.A.6C1.html
推 leoblack: 可試試讓細胞減量然後貼著2天後再做
推 greenwind: 細胞seeding不平均或是可以試試7?10^5/well
推 leoblack: 細胞seeding完有用十字搖盪法讓細胞均勻嘛？
推 xenograft: 你要不要讓細胞完全長滿再做啊？看起來像是細胞沒長好
推 jabari: 燙
有用十字搖法
我會試著貼兩天 滿一點再做看看
謝謝大家~~~
※ 編輯: jenna2bb (42.68.204.26), 04/10/2015 15:09:01
推 nprotei: 比較像燙死
請問燙死是agar的溫度嗎 我是放在42℃
※ 編輯: jenna2bb (42.70.238.153), 04/13/2015 17:59:35
推 nprotei: 建議用感覺的 加之前去感覺他的黏滯性加
→ nprotei: 如果還是覺得是因為沒長滿 可以做實驗前顯微鏡下看
→ nprotei: 而且正常加 overlay 後細胞還會長
推 leoblack: 55℃ 2X Agar+37℃ 2X medium, 1:1 混合後馬上用
非常謝謝大家~~
我後來讓細胞長滿 agar改成40℃就成功囉
覺得主要是因為細胞狀況沒那麼好
所以42℃對細胞來說太燙
給以後遇到同樣狀況的人參考
※ 編輯: jenna2bb (163.25.95.173), 05/05/2015 10:43:53