[求救] PCR product 定序

[shinchenboy (欣承男孩)]

各位版友大大好

最近小弟在做PCR定序的實驗

想檢驗我PCR的產物是否如自己預期想P出來的片段

PCR產物的片段約200bp

做法是PCR之後跑膠 然後從膠中萃取並純化DNA

根據跑膠的結果發現位置如自己預期是在200bp的位置

從膠中萃取PCR產物後的DNA總量約900ng 濃度30ng/ul A260/280在1.8左右

然後送到學校的共儀去做定序

送定序的DNA sample我取總量15ng配成總體積5ul 再外加1ul的primer(6uM)

定序的Primer我是直接用PCR Forward的Primer

最後出來的結果 一開始定的序列既不正確也很奇怪(就是一堆亂碼...)

大概是到了第30~40個bp後定出來的序列才跟我的預期是一致

簡單來說就是前面30~40個bp序列是不對的(參雜亂碼)

之後的序列就都跟預期的一致

我想問說就是這樣的情形可以說是我PCR定序的結果是成功的嗎

根據實驗室學長的說法好像定序一開始出來的序列的不太可信

還是說我要用Reverse的primer來定反股來做一個雙重的驗證???

想請教各位有經驗的大大們了~~~感謝














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→ blence: 是看ab1檔還是txt檔？
推 ayumi7667: 定序請設計另一條引子 以pcr引子定前幾個字會不準 一
→ ayumi7667: 般定序公司會有說明
→ shinchenboy: 兩種檔都有看 不過兩種檔的結果不是都一樣嗎???
→ blence: ab1其實可以人工判讀看出seq是不是真的有異
推 jabari: 好一點還可以看heterozygote  XD~
→ Ianthegood: 本來就會這樣 前50個mer訊號都會亂七八糟
→ Ianthegood: 想看前面大概都會送進sequencing vector裡面
→ roy047: 可反方向定回來即可知道最開頭序列
→ lail: 這是正常的，所以你需要再從另一端讀回來
推 soend: 正常的 不然就做個TA clone即可
→ Ice9: 這是正常的。primer 後大約 20~30 mer 訊號本來就會差。
→ Ice9: 想知道完整序列，可以選 Ianthegood 或 roy047 的方法。
→ Ice9: 另外，看預列還是用波狀圖(ab1?)檔比較精確，文字只是輔助。
→ Ice9: 文字有時會出錯，你得回去看圖形檔判斷。