[求救] 有關於抽BAC以及PCR的問題

[TWX5566183 (塵世中一個迷途小五六)]

各位版友大家好 最近在抽BAC (約150KB) 遇到了一點障礙

首先 我是使用GENEAID的一般抽MIDI的KIT

但經過合作教授修改後在PROTOCOL上有些許的不同



首先我先養250ml的菌 隔夜後離心6000 去懸浮液後取細菌PELLET

P1P2P3各加6ml 其中P2作用十五分鐘 P3也差不多作用15分鐘 (無VOTEX)

接著再將白色渣給離心離掉 取上清液直接加入isopropanol等體積沉澱並離心

接著用酒精wash後風乾 使用PEQ (通column的buffer) 回溶

最後將回溶完的液體拿去過column (已用PEQ通過) 並WASH

我最後PEL elute時將PELbuffer加熱到65度elute 再用同體積的isopropanol沉澱離心

最後回溶的DNA總量約是50-125ug左右 不知以上protocol是否有錯誤呢



另外還有PCR的問題 因為我想要在BAC上P出一段約2600BP的產物

因此我大概將30ng的DNA和PCR mix混合並跑35cycle 不過跑出來沒有結果

然後我也將細菌直接去做colony PCR

不過跑出來還是沒結果 老闆說是因為BAC低拷貝數量的關係P不出來

不過我colony PCR跑不出來還是第一次遇到就是了...



懇請各位先進解惑 多謝各位

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推 jabari: 切一切看看??
→ williamyang: 我已前抽BAC,酒精wash完,風乾回溶後就沒過column,
→ williamyang: 不太清楚為何要過一次column?
推 chaunen: 試試PCR完再拿1ul做第二次PCR ??
→ Ice9: 先 P 個那 2600bp 內部的短片段看看是不是有產物。另外，GC
→ Ice9: content 太高，也很容易amplify不出東西來。