[求救] TRIZOL 抽 RNA的pellet形狀

[ducky313 (Lara)]

想請教大家幾個關於用TRIZOL抽RNA的問題..

步驟大致上都是照著說明書上的進行

收集sample時 TRIZOL加 750 ul

chloroform 加 200 ul後 搖晃混濁靜置 3-5 分鐘後離心

接著抽取水層上清液 水層大概是有 400 ul

我只取了 100 ul或200 ul 加入400ul的isopropanol，搖晃混濁靜置10mins後離心

第一個問題是

在離心後會出現RNA pellet 說明書上寫的是"gel-like"pellet

而我出現了兩種

只取100ul的是gel-like半透明的pellet

而取200的白色羽毛狀(一條線)的pellet

接著都進入後續步驟

在最後用nanodrop定量時

gel-like的濃度在60ug/ul左右，260/280在1.8-2之間，但是260/230則只有1以下

羽毛狀的則濃度在100ug/ul左右，260/280在 1.5-1.6之間，260/230在2左右或是1.5-1.6之間

搜尋了網路上的討論，造成此差異的原因好像是isopropanol的量不同造成樣子pellet不同。

想請問大家..
1.正確的pellet是什麼形狀才對呢 ?
2.一般來說260/280太低是蛋白汙染，但是我很確定我沒有抽到最下粉紅色層的(很注意盯著看Q口Q)為什麼還是會污染呢?
3.260/230低是鹽類汙染，會用75%EtOH wash來改善，想請問大家wash pellet的方式是?會vortex嗎?
4.說明書上的cholorform建議是和TRIZOL 5:1 請問可以增加嗎?會增加水層的量嗎?
5.如果想將已經回溶在DEPC水裡的RNA在沉澱有建議的方法嗎?

問題很多 麻煩大家了 ! 謝謝 ~~


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※ 編輯: ducky313 (36.238.243.141), 04/17/2015 21:17:59
推 huuban: 5>>加3倍體積的100%EtOH和10分之一體積的3M NaOAc
→ huuban: -80半小時或-20 o/n，然後4度離心半小時再用75%EtOH Wash
→ huuban: 4>>是5分之1，還是5:1?
→ ducky313: 好像打反了是 1ml的TRIZOL加入0.2ml的choloform 謝謝 ~~
→ mcy0326: 我抽出來算是你說的一條線狀，我們用trizol:Chloroform=5
→ mcy0326: 00:100，isopropanol 250ul，抽出來濃度有500～600ug/ul
→ mcy0326:  (3T3L1 cell)，260/280約1.98～2間
→ huuban: ug/ul...我們這邊抽植物有1000 ng/ul就很高興了 (淚奔)
推 Ianthegood: pellet狀態不同大概只是量的不同...