[求救] Bisulfite PCR

[freakshow (freakshow)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題

若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

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最近在做Bisulfite PCR
目的是處理過Bisulfite的gDNA要用PCR放大 把片段純化做TA+sequencing
目前是抽完gDNA 260/280有1.9 260/230有1.8
拿500ng gDNA做置換!
我是用EpiTect Fast bisulfite conversion kit(Qiagen)
Q:
1. 請問我該取多少ng的biDNA去跑PCR
   以及我該用Hotstart Taq做嗎?
2. Bisulfite-PCR 的primer設計有推薦的網站嗎?(目前是用Methprimer..)
   上面那設計出的primer有做過一輪 完全沒band...
3. primer的長度,Tm值 有比較建議的嗎?
4. PCR 的protocol有針對biDNA比較好的溫度時間嗎?


ps.我們實驗室沒有學長姐會做這實驗 老師也只叫我做   沒轍阿!!!
謝謝!!!!!!!!!!
(被苦惱已久的小小研究生敬上!)

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.213.20
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1429431234.A.433.html
→ freakshow: 附註: 不是bisulfite MSP 是biPCR! u跟m都必須P出產物
→ freakshow: 先前有google到一個bisulfite的超詳細說明 裡面說prime
→ freakshow: r要加M13tail 但我加了還是P不出來...Tm也變62超怪
推 Bows: 自己設計阿，methylprimer只是參考用的，你只要避開CpG就可
→ Bows: 以U跟M都p出來了，我們家主要還是以50/50 CG/AT
→ Bows: 然後是用hotstar Gotaq再跑，另外假設primer在CpG site上的
→ Bows: 話，也可以用 Y (C or G) 下去抓，不過這樣雜band會比較多
→ Bows: 另外DNA的量要看你的primer specific
→ Bows: 我們是轉300ng ，PCR用2去跑，有些primer會很濃，但有些
→ Bows: 用2跑會太但，所以就用4~6去跑這樣
→ Bows: *轉300ng elute 10μl
→ freakshow: 50/50 CG/AT看不懂..另外想知道產物要設計多少bp最佳?