[求救] cDNA取量問題(Realtime PCR)

[kgwu (徵5/2 獅象戰內野優待票)]

這問題可能有點基礎

不過小弟第一次做realtime PCR

因此還是發文請教了...


RNA轉cDNA步驟:

假設我有A，B兩個sample

A sample: 1ug RNA要取0.38 ul

B sample: 1ug RNA要取0.72 ul

轉cDNA的時候我就取A sample 0.38ul和B sample 0.72ul

也就是各取1ug的RNA去轉cDNA


這樣我要上機做Realtime PCR之前

cDNA要再做一次定量嗎?

還是我A sample和B sample的cDNA不用定量，直接取1ul就會取到相同的量?


請版友不吝指教了 謝謝!

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推 lail: 我cDNA沒再定量，但跑resl-time PCR時會跑internal control
→ lail: ，理論上二樣本所得之值不會差太多
→ blence: 轉完RT的cDNA很難精準定量
→ supray: 轉完RT的cDNA通常不會純化,就直接做qPCR,所以不會定量
→ supray: 沒純化過,定量沒有意義
推 jabari: 有reference就不用定量啦 ... 都是比2-△△CT
→ kgwu: 感謝大家的回覆!
推 as862437: cDNA 不用定量？會不會每一體積濃度差很多造成 ref cycl
→ as862437: e數差很多？
→ a90648: 轉RT時RNA一定會定量啊!!理論上等量RNA轉出來的cDNA量
→ a90648: 這在internal control的Ct值就看得出來，如果差很多
→ a90648: 反而要注意這麼大的誤差是怎麼來的
→ a90648: 等量RNA轉出來的cDNA量應該差不多
→ as862437: 謝謝樓上 解惑ㄌ
→ as862437:              ^了
→ Ice9: 用 pipetman 取 1.0 ul 以下的東西，你覺得這樣會夠精準嗎？
→ Ice9: 還不如相信 qPCR 做的 internal control。
推 shinchenboy: 我RNA萃完就會先定量再轉成cDNA
推 shinchenboy: 轉成cDNA後就直接做PCR
→ shinchenboy: 不用再定量一次