Immunofluorescent 一直染不出來

作者s64123 (嘿嘿)

看板Biotech

標題Immunofluorescent 一直染不出來

時間Sun Apr 26 16:27:53 2015

想詢問各位大大冷凍切片後我染特定細胞的 receptor (tyrosine kinase receptor) 但染完都沒有我要看得細胞應該說 POSITIVE 跟 NEGATIVE 是同樣亮度的步驟如下 0.01 M PBS wash 5min*3 2% NGS-0.1% BSA- 0.2% Triton blocking 5 mins 10 % NGS-0.1% BSA- 0.2% Triton blocking 20 mins 0.01 M PBS wash 5min*3 add primary antibody overnight at 4 度C 0.01 M PBS wash 5min*3 add secondary antibody 30 mins 0.01 M PBS wash 5min*3 coverslip 一抗是新買的想請各位知道哪裡出問題嗎? 感謝 > < 發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出以方便板友幫您追蹤問題若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，請務必註明貴實驗室願意設立正式合作或簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.27.47.78 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1430036875.A.030.html

→ stone1105: 1跟2抗濃度是? 有時候抗體濃度調整一下會好很多 04/26 17:05

推 bpjp: 二抗之後有嚴格避光嗎？你沒寫到 04/26 21:14

推 bpjp: 不對，有亮就跟避光沒關係了 04/26 21:15

推 tz2733: 為何使用triton? 要染的蛋白在細胞內? 04/26 21:38

推 tynse71864: 丟一抗之後的wash 我都會用PBST耶 04/26 23:27

→ tynse71864: 你的negative ctrl是只有二抗還是加IgG 04/26 23:28

→ s64123: 加二抗 04/27 08:16

推 Tubar: 1.可能你的一抗efficiency不好，好的抗體讓你上天堂，爛抗 04/27 10:15

→ Tubar: 讓你染到頭抱著燒 2. 可能此細胞內receptor表現量少，所以 04/27 10:15

→ Tubar: 你會看不到，可以試試市面上放大訊號的KIT 04/27 10:15

→ blence: 推樓上,原po未提及此一抗用在IF是已知的,也未說明postive 04/27 11:01

→ blence: 是否來自已知的細胞,這兩個因素比調整condition來得重要 04/27 11:02

→ s64123: 但很多文獻資料都表示此一抗是確定可以染出我要的細胞的 04/27 11:09

推 Tubar: 你目前的做法看起來沒有太大的問題，我認為主因還是在Ab和 04/27 12:23

→ Tubar: Ag上，朝這兩個方向去做troubleshooting 04/27 12:24

→ s64123: 謝謝大家 04/27 13:05

→ ad1980: 一抗有用在 WB 上試過嗎？ 04/30 02:27

→ s64123: 有很明顯!! 05/01 22:13

推 jabari: 要說細一點的話..你用了triton破膜但後面沒用tween20讓 05/02 16:52

→ jabari: 孔洞維持..可以洞洞縮起來了?? 05/02 16:52