推 williamyang: blunt end PCR產物推薦用pjet1.2 vector,很好用 04/28 11:58
→ Ice9: 你的insert或vertor，得至少有一個5'-end有phosphate group 04/28 12:04
推 smallhowhow: A tailing taq處理 72c 3hr 04/28 12:04
→ Ice9: 另外，抽完 Plasmid 怎麼會直接拿去定序呢？跑個膠先看看才 04/28 12:09
→ Ice9: 對啊。你insert：vector很接近，在膠體上很容易分辨出來的。 04/28 12:09
→ Ice9: 還有，你在 ligation 步驟中，加了多少 ligase？ 04/28 12:14
→ Ice9: 要不然就是使用會在 3'-end 自動加 a-tail 的 polymerase 04/28 12:17
→ Ice9: 對了，也有可能是 ligase 的問題。ligase 非常 labile，以前 04/28 12:24
→ Ice9: 實驗室剛買來，就先用冰的tube分裝4或5λ，編號冰起來，依序 04/28 12:29
→ Ice9: 從-20℃取出使用。 04/28 12:31
→ Ice9: 還有，ligase處理完，可以用65或72℃處理5 min…… 04/28 12:36
→ Ice9: 最後，OD value 它就不會是濃度單位。你的敘述要再修改。 04/28 12:38
→ blence: 這個protocol好奇怪,你有大量樣本更不需這麼麻煩的作法 04/28 13:14
→ blence: 直接用pJET那套就省事多了 04/28 13:16
推 jabari: 有錢買topo啊 QwQ 04/28 14:49
→ ct13732: 回ICE9前輩 我加了2ul ligase，想請教抽完plasmid 跑膠是 04/28 17:14
→ ct13732: 是用酵素re切跑膠麻？還有謝謝od的指正，我想表達的是濃 04/28 17:16
→ ct13732: 度的部分，我使用的是pfu tag 所以需要加a tailing 04/28 17:19
→ ct13732: 那我要怎麼確定我的產物端有磷酸化？ 謝謝前輩 04/28 17:22
→ ct13732: 回williamyang blence 謝謝你的建議 因為這一方面的經驗 04/28 17:25
→ ct13732: 驗沒有很多 我會好好研究一下 謝謝你們 04/28 17:26
→ blence: 文中沒提,你的colony沒有藍白挑過？ 04/28 17:58
→ ct13732: 回blence前輩 沒有 實驗室學姊的步驟就是我上面步驟的 04/28 19:33
推 supray: PCR product 50ng/ul 取1ul跑膠 不會只有很淡的band 04/29 09:18
→ supray: 或許你的產物不夠專一 04/29 09:19
→ supray: 咦 我漏看了 怎不做藍白篩呢？ 04/29 09:23
推 chaunen: 設計跨vector inser 的primer 做colony PCR 不然就藍白篩 04/29 17:46
推 chaunen: 其實ligation完可以先PCR看看是否有接進去 04/29 17:51
推 chaunen: 同步做先前成功的樣本 當做整個過程的postive control 04/29 18:22
推 chaunen: 如果RT-PCR完的產物只有1種or目標產物最多 直接clean up 04/29 18:44
推 chaunen: 甚至Pfu完直接加1ul taq 做3'端的A之後再clean up(要試) 04/29 18:55
→ chaunen: 跑膠切膠的步驟應該是可以省略的 04/29 18:57
→ chaunen: 很淡的band應該都是偽陽性 猜primer沒有跨vector& inser 04/29 18:59
推 chaunen: 沾菌的時後取到微量塗盤時的linear vector 04/29 19:08
→ ct13732: 回前輩chaunen 謝謝你的建議 我會先ligation 跑跑看 05/01 16:51
推 tigernaxo: 要不要試試用kinase處理insert 05/01 22:47