推 jabari: 45 cycles後的東西準嗎奇??04/29 16:10
推 caesar0926: melting curve呢??04/29 16:16
→ caesar0926: 現在的機器應該會autobaseline吧??且太多cycle也不行.04/29 16:18
推 dirkwen: 沒記錯，大於33個cycle後比較沒意義了04/29 17:05
沒有做melting curve @@
兩組都是隨cycles數 螢光值有著漂亮的s型(倒)上升曲線 但一個s比較高 一個比較低
但沒注意33cycles以前是不是profile一樣@@ 晚點來看看 :)
※ 編輯: simoncharlie (42.70.80.232), 04/29/2015 17:24:34
→ a90648: 附個圖吧!! 基本上45cycle後的東西不用管了啦 04/29 17:24
→ a90648: 測試primer melting curve 一定要做 04/29 17:25
→ a90648: 不然不知道primer專一性如何 04/29 17:26
→ a90648: 沒注意，你是用taqman system的話就還好@@ 04/29 17:29
推 chaunen: 所以可能只是A,B組primer在PCR效率上的差異囉? 04/29 18:15
推 jabari: probe不用melting啦 可是45cycle的話quencher應該也掉了XD 04/29 19:44
→ Ice9: 真不不要在意 45 cycles 之後的事情了。就連 35 cycles 前若 04/29 19:52
→ Ice9: 是 curve 不美，我都要抓頭了。 04/29 19:54
圖來了! 怎麼辦 好像長得不太一樣QQ!
http://ppt.cc/7cgH
三重複 所以有九條線
比較高的六條 就是A和C組primers/probes 的結果
比較低的三條就是B組
用來算Ct值得那條橫線(baseline threshold) 是軟體拉的
九條線都落在 15 +- 0.25 @@
※ 編輯: simoncharlie (118.160.113.18), 04/29/2015 21:39:44
→ Ice9: 很漂亮的圖啊。你只要看 30 甚至是 20 cycles 之前的就可以 04/29 22:55
→ Ice9: 我還覺得，就 primers 而言，B組在 16 cycles 前就比A或C其 04/29 22:56
→ Ice9: 中之一還『敏感』。我大概會選B組來做。 04/29 23:01
→ simoncharlie: 請問怎麼看得出"敏感"呢?! 04/29 23:22
推 supray: plateau的螢光值跟你的amplicon size有關 04/30 12:48
→ supray: 多少莫耳數 最多就只能轉出多少產物 04/30 12:50
→ supray: ^primer 是限制試劑 04/30 12:51
→ supray: 同莫耳數 片段大的螢光比較強 04/30 12:52
→ supray: 以上對sybr的qPCR來說 04/30 12:55
→ supray: taqman probe 的 我覺得變異更大 04/30 12:56
推 jabari: -.,- 沒差 04/30 21:30
推 jabari: 原po這個 其實跟probe效率比較有關 而且跟螢光組合也有關 04/30 21:33
→ jabari: 係 更甚者 如樓上大大說的 primer夾的效率也有關係 04/30 21:33