→ milkpa: 實驗室有抗其他抗生素的plasmid嗎，拿來換一換就好了 05/01 11:49
推 licat: 查有沒有適合的酵素切位把amp gene切掉 接別的進去就好 05/01 11:51
有Kanamycin、chloramphenicol的抗性載體
amp resistance前方緊黏T5 promoter
還是只要把AMP部分截掉就好了??
※ 編輯: babylikeg (163.20.181.88), 05/01/2015 12:03:02
推 liuse: 沒RE的話可以設計homologuous recombination換進去 05/01 15:01
→ liuse: 但要在特殊E. coli strain 05/01 15:02
推 eric1210: 先把map調出來 ，應該會有可切掉amp的位置 ，切掉後由 05/01 15:11
→ eric1210: 其他plasmid的抗生素片段來塞進去 05/01 15:11
→ eric1210: 切掉amp部份就可以 ，T5不用 05/01 15:12
→ Ice9: 我想到的是類似 liuse 的作法：將Amp vector 和要製換的XXX 05/01 17:23
→ Ice9: vector 放在一起。設計 forward primer 前半段在 amp vector 05/01 17:24
→ Ice9: 上，後半段在 xxx 抗生素的 5'-end 上，然後 reverse primer 05/01 17:25
→ Ice9: 的前半段在 amp 3'-end 之後的原 vector 上，後半段在 xxx 05/01 17:26
→ Ice9: 抗生素的 3'-end 上，當然要比一般 primer 要長一點。然後拿 05/01 17:28
→ Ice9: 去 PCR amplify。最後3種 plasmid 的大小應該有差，切膠分離 05/01 17:29
→ Ice9: 要不然拿 DpnI 處理過是最好。 05/01 17:31
→ Ice9: 最後再拿去 transform 量產和定序。 05/01 17:32
→ Ice9: 咦，不對，這樣會有四種 plasmid 。把 xxx vector 先用RE切 05/01 17:34
→ Ice9: 到包含 xxx 抗生素 DNA 的最小片段，分離純化，再和含 amp 05/01 17:35
→ Ice9: 的 vector 放在一起進行 PCR 量產。 05/01 17:35
→ blence: 我用過上面的方法塞入最長1.5k,同時踢掉幾10bp,不過是先放 05/01 18:36
→ blence: 大xxx後先純化,再以此當primer以site direct去換amp vectr 05/01 18:41
→ Ice9: 我自己没塞過東西，而是用類似的方法進行同一段 DNA 上不同 05/01 22:31
→ Ice9: 片段的置換，所以想說以前的方法，原 PO 可以考慮。blence 05/01 22:34
→ Ice9: 的方法更簡單，但我們兩者的 primer 設計應該是一樣的。 05/01 22:36
→ Ice9: 而 blence 的方法應該會能省 primer 的設計長度。 05/01 22:40
推 e104582001: 感覺買新plasmid會比同源互換較多錢XD 05/02 03:14
→ e104582001: *省 05/02 03:14
推 chaunen: 可以先上addgene找看看有沒有適合的 05/02 11:03
推 jeol1620: 可以試試看PIPE cloning 可以做deletion,insertion 05/06 22:01
→ jeol1620: 放新的基因要4條引子，deletion,insertion兩條就夠了 05/06 22:03
→ jeol1620: 兩條引子P完用dpnI背景切乾淨直接電穿孔，只是變沒抗性 05/06 22:05
→ jeol1620: colony PCR要多篩一點 05/06 22:05
→ jeol1620: Ice9大大說的感覺是RF-cloning 05/06 22:06