[求救] Western Hy抗體的步驟

[grassshan (紙飛機啊歐歐踢欸死)]

先感謝板上AR大對於培養3T3-L1的寶貴建議～
我順利收下細胞最近在做Western Blot

但在Hy抗體的部分大卡關了～
除了reuse 的actin外
其他都一直失敗Q__Q

在猜步驟中可能錯誤的就是Hy抗體的地方了！（我有一次用reuse的PPAR gamma一抗有出現一條有點斜的Band)


我Hy 一抗是使用 5%PBST泡的脫脂奶

抗體跟奶的比例是1：1000

加的方法是先在方形小盒加入5ml 奶
先稍微在盒中晃勻，確定可以覆蓋盒底體積後

在盒中六個點分段加入抗體
（左上 ，中上，右上）
（左下，中下，右下）

加完後就利用Tip在盒底劃勻抗體
（左上斜紋劃到右下，
右上斜紋劃到左下，
上（下）橫紋劃到下（上），
左（右）縱紋劃到右（左））

我試過放4度C冰箱over night 跟一小時…

但都依舊很白Q__Q

二抗也是都一樣的方法，
actin 出來還蠻明顯的，
所以我在猜是不是我Hy一抗的步驟怎麼了？

請各位大大提出意見>_<～




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→ blence: 有時間紀錄抗體怎麼mix,那一定有時間配在離心管vortex了
→ blence: 這類的文章未看先猜,沒證據證明抗體有效
→ grassshan: 學長一年前畢業買的抗體@_@
→ grassshan: 他的論文是跑出來有結果的
→ grassshan: 我用reuse 有結果
→ grassshan: 我自己加的沒結果
→ grassshan: 所以我才懷疑是我的步驟問題…
→ grassshan: votax的部分我在今天的實驗有試過但我只壓震約5秒就倒
→ grassshan: 回盒子中，一樣是一片空白…
推 tynse71864: 感覺就是抗體壞了
→ grassshan: 抗體那麼容易壞了喔…………
→ Ice9: 樓上，因為是 reused，所以應該是牛奶壞了導致的
→ Ice9: 對不起，我眼斜了。他的 reused 没問題……
推 jabari: 抗體datasheet拿出來看一下 說不定是保存失當
→ turtle24: 拿錯管或是原管壞了?
推 ararthur: 我沒聽過這種加法耶 就直接load進盒子 讓他搖個幾分鐘
→ ararthur: 應該就勻了阿 丟多少量的protein? 會否量太少染不到 act
→ ararthur: 深嗎? 或許下次牛奶換成BSA 我常常BSA比牛奶染得出來
→ wang987: 想問原po,用tip劃box的原因是？？
推 ararthur: 恨XD
→ a90648: 我比較好奇加抗體的方式是自己發明的還是別人家教的XD
→ grassshan: 沒拿錯管～這是實驗室流傳的加法 XD 說這樣比較勻…
→ chvkimo: 我抗體加到牛奶裡面後 稍微混管子 然後就倒到膜上去了
→ chvkimo: 放在shaker上搖一個小時 會不均勻嗎?
→ chvkimo: 如果你要同時做6片  這樣混法 會花多久時間? 好奇