[求救] 關於 Bacillus 屬的鑑定

[kimisky (kimi~)]

各位前輩大家好
這陣子在鑑定從土壤中分離到的細菌菌株，遇到了一些問題
希望可以在這邊獲得解答...

我目前是以16S rDNA的基因先解序
解序出來的結果去NCBI跑BLAST，
跑出來的前50個結果都是同一屬的，種之間則是有些差異
(即自己的菌株結果皆為Bacillus，其中一隻菌株則是Brevibacillus)
而且 E value 皆為0、Ident 皆為99% 左右

我將其中幾個BLAST結果的序列下載下來(包含不同種的)，
利用ClustalW2網站或mega軟體去跑親緣樹
但發現畫出來的樹都醜，親緣關係都很遠
甚至我拿NCBI網站得到的Brevibacillus之序列去比對，
其中一隻Bacillus的親緣關係竟然比原本鑑定為Brevibacillus的那隻菌還來的更近
(但前者跑BLAST完全沒有Brevibacillus的結果QQ...)

現在遇到瓶頸了。
起初選用16S rDNA的基因是認為他保留性很高，應該很好鑑定
但仔細想想，或許這樣反而不好將菌株鑑定得太仔細...
也很困惑到底是選錯了基因、還是我的操作方式出了問題Q_Q...

我現在重新思考幾個解決方式：

1. 選用其他 Bacillus 的其他基因，做多基因序列比較：
這方法或許是最佳也最省錢(?)，但其實我這兩個月有些水深火熱，
再加上找文獻做實驗的時間，實在很擔心。
又若找尋的基因不完全適合鑑定自己的菌株...感覺或許是又繞了一大圈T_T

2. 使用人工試驗套組：
這是剛剛查文獻時看到的方式，選用的是 API 50 CHB 這個套組
其是可以鑑定22種的 Bacillus 及其相似種
已經有多篇paper用過，疾管局亦有公告此檢測方式
但我們實驗室沒有這種東西...剛剛也查不到到底是哪間販售的 Orz
不知道有沒有人使用過呢？
因為其是以菌株的碳水化合物利用來鑑別，不知道這樣的生理生化的方式，
鑑定的結果是否會比分子生物學更加準確...

另有查詢到另個套組，是 Microgen® Bacillus ID
號稱鑑定出來的準確率比前者還高，但我一查他的售價要一萬台幣.....
以本實驗室的財力，無法應付 Orz...



我並沒有要鑑定到太過詳細的資訊
老師希望我至少要鑑定到種...
我想老師會希望我用最省錢的方式，得到最正確的結果 (廢話)
這樣看來是否還是方法1較為推薦呢....?

由於本人的研究領域並非在分子生物學Q_Q...所以對這方面蠻苦手的
還請大家鞭小力一點，並請多多指教...
非常感謝！！！



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推 Ianthegood: p出來片段多長? 通常就是最上面那個 鑑定沒有在跑樹的
P出來片段都是1600 bp左右，但出來的結果數值都很接近，所以真的無法確定..
而且我拿前幾個分別去align，相似值卻都很低..所以很納悶
推 payton103075: AP啟新有 這偏生化特性 或者有考慮直接送出去鑑定嗎
請問是指將菌株直接送AP鑑定嗎? 有公司有這類的服務嗎>"<? 不然我也很想這樣T_T...
→ Ice9: Identity 99%，長度 1600，表示只差16個bases的不同。那很高
→ Ice9: 了耶。但是，你要仔細看 NCBI 做 Blast 有可能不是拿全長啊
→ Ice9: 在 blast 時用到的序列長度，和你下載時的序列長度很可能不
→ Ice9: 一樣。畫親緣樹會有極大差異是可以預見的。所以，NCBI 只會
→ Ice9: 讓你知道有哪些很接近的東西，但是進一步的序列全長分析，
→ Ice9: 你在要分析網站或軟體上微調一些條件。這一方面，你最好看一
→ Ice9: 下相關的 papers，看條件設定是怎麼設的。
沒錯，我blast之後的片段大小幾乎都是兩千多的@@...
這確實在讓我畫親緣樹或align時有點困惑...
謝謝您的解釋和建議，我會再去請教老師或有做相關實驗的同學>"< 或是看看相關paper
真的很謝謝大家的意見!!!
推 gggghana: 今日儀器有賣API套組，啟新好像是賣Remel-RapID，這類
→ gggghana: 的生化鑑定套組通常是為了方便(節省配製時間)得知菌種
→ gggghana: 的生化特性，價錢不便宜，試劑條或試劑的期限大概半年
→ gggghana: 到一年。至於試驗結果的顏色判讀算是比較主觀，但也是一
→ gggghana: 個數據啦~
推 gggghana: 對了，鑑定Bacillus的primer, 16S rRNA可能差異不大，
→ gggghana: 有看過paper用其他基因片段做鑑定，你或許可以試試
謝謝樓上!!! 啟新我昨天找了一下，好像沒有賣API，剛剛有去信詢問今日儀器了!
我問了曾經做過此屬細菌的同學(早該問了Orz...)，確實他說16S rRNA分不太開
得要利用Biolog或其他的生理生化才能確認其屬...
至於需要哪些測試就得要看我自己的需求了！
真的很謝謝大家的解答...T_T

如果有大大有做過此屬的API測試，是否也請能分享一下經驗呢?
謝謝！
※ 編輯: kimisky (140.120.196.16), 05/18/2015 13:52:37
→ kimisky: 今天詢問廠商了，果然是非常不親民的價錢...Orz
→ kimisky: 我再跟老師討論看看要不要直接換做 Biolog 好了~謝謝大家