[求救] western blot位置不對

[daffinger (daffinger)]

最近做western,好不容易終於看到band了
但是發現跟網頁上的位置不同
網頁上大概55Kd，我的大概落在40Kd
control組跟treatment組都一樣(所以應該不是因為加藥造成修飾的問題)
band很明顯也沒有雜band
請問是蛋白質degraded嗎?(加sample buffer煮5min，冰-80度)
還是煮蛋白的溫度太高(大概有95度以上，根據別人的方式)?
RIPA的反應時間太久會這樣嗎?(4度放了有一個小時)
有爬文說marker不一定準，要看loading control (是這樣嗎?)
新手發問，請多見諒
謝謝



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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1432051283.A.6B9.html
→ blence: 現在多數公司的抗體sheet有一定比例的size是錯的
→ blence: 請用genecard等網站查詢物種標準MW或再si等以確認位置較好
→ Ice9: isoform (tissue-spicific)?
推 ararthur: datasheet不要太過相信 各種modification, isoform,
→ ararthur: conformation, dimer等 都有可能出現位置不符
→ Ice9: marker 和 SDS-PAGE 濃度也會影響判斷。
→ Ice9: 還有 protein 有没有被修飾也會是位置不同的原因之一。
→ blence: 實驗技術上的錯誤是可以接受的,位置不同的解釋,abcam每支
→ daffinger: 發現gapdh也大概差10Kd左右，請問marker會有問題嗎?
→ blence: 目錄也都有位置非預期的解釋,但其實不少問題是各家公司自
→ blence: 行剪貼別家OEM的產品,把含tag訊息移除等,非實驗的錯誤
→ blence: 原po會不會是prestained都是藍色,整個marker位置都錯估
推 ararthur: marker用兩個牌子平行一起跑看看吧
→ ararthur: 我的經驗是 marker不準也不會差太多 特別是你的size也還
→ ararthur: 在常見range之內 過大或過小的band MW比較容易差的大
→ Ice9: 你把圖放上來看看吧。另外，可以詳加說明實驗條件嗎？
→ daffinger: 謝謝大家，我下次先換一個marker試試看
→ cmid05: 我前兩天 害我剪到band