[求救] pcDNA3.1(+)stable clone建立

[shinchenboy (欣承男孩)]

各位版友大大們好

最近小弟的實驗要開始建立以pcDNA3.1(+)為載體的Stable clone MCF7細胞株

建立的方式參考學長姐的實驗記錄以及pcDNA3.1(+)的產品資訊

主要的方法是先把pcDNA3.1(+) transfect到MCF7細胞之後

隔24小時後有收一些細胞下來觀察transfection有無成功

然後剩下的細胞則是繼續培養在含有抗生素G418的medium中

來篩出stable clone出來 每2天要換一次medium 大約要篩2週

G418最後在細胞中的濃度是1ug/ml(此濃度是參考畢業學長姐的論文)

根據RNA定量的結果證實transfection是有成功的

但是剩下來培養在含G418的細胞卻發生以下的現象:

1.一開始剛加G418的時候好好的，隔天看細胞發現細胞有凋亡大約5成，再隔天看

 發現細胞凋亡大約到7成了...(存活下來的細胞只剩3成)

2.後來我換了一次medium，重新加入G418，隔天再看一次細胞，發現已經凋亡了約9成

  ，再隔天看一次細胞，發現存活下來的細胞屈指可數......

想要問版友大大們這樣的現象是正常的嗎?

我的理解是加入G418最主要的目的是為了要殺掉沒有被成功transfect的細胞

讓有成功transfect的細胞存活下來

但是今天我的細胞再加入G418後幾乎都死光光了

可是從RNA定量的結果來看我pcDNA3.1(+)應該是有成功送入MCF7才對

所以會不會是以下兩個問題

1.G418加入的濃度過高:加入的濃度條件是我參考學長姊的畢業論文，他們用的plasmid

和細胞都和我一模一樣，所以我想說這個濃度應該是很適當的才對

2.選用的抗生素不恰當:pcDNA3.1(+) vector內包含抗Neomycin的基因，G418是Neomycin

的衍生物，所以我想說應該也不是這個原因才對

拜託了各位大大們 小弟會感激不盡

小弟我好想要趕快畢業阿QQ
















--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.121.119
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1434000758.A.862.html
→ a90648: stable clone是指你送進去的plasmid有插進genome中
→ a90648: 數量本來就不會太多了，不會你的細胞我沒使用過所以不知道
→ a90648: 一般狀況下成功率有多少
→ a90648: 而且你一開始送進去後抽RNA轉RT去看結果基本不准
→ a90648: 即使有處理DNaseI還是有很高機會去P到plasmid
→ a90648: 要確認的話我們實驗室一般是用western或是co-transfect
→ a90648: GFP plasmid
→ a90648: 細胞有亮基本上就表示有transfect成功，但是要變stable
→ a90648: 還是會因為細胞不同成功率會差很多
推 FYT0429: G418的使用濃度你可以先用96孔盤來測試，
→ FYT0429: 找到lethal concentration再往下調100~200 ng/ml
→ FYT0429: 有時候這些東西在不同人手上就是不一樣，玄玄der
推 MDCCLXXVI: 用G418 ok
→ blence: 你把transfection成功當做是stable candidate了,其實差異
→ blence: 很大,如果G418加了不會死,那當初就不需特別用G418篩了阿
→ blence: 你這裡的G418不只是殺"沒有被transfect"的細胞,而是要殺
→ blence: non-integrated"的細胞,所以才會被稱為stable clone
推 wanderchang: 私以為stable clone 至少是一個月的事？需要讓時間
→ wanderchang: 把transient， not-so-stable 跟stable clone區分開
→ wanderchang: 來
→ Ice9: 你的問題2很嚴重啊。我覺得有些東西你不弄清楚，還是緩點畢
→ Ice9: 業的好。  ps. 一個是 phosphotransferase 一個是antibiotic
→ Ice9: 嘖！抱歉，我眼殘了。自打臉～～
→ Ice9: 我個人是覺得你transfection可能並没有你想像來得高。一是用
→ Ice9: a90648網友說了的，你測試的手段太單一，而且可信度可能不大
→ Ice9: 二是你的control組的死亡率如何？我猜也和你的實驗組一樣的
→ Ice9: 速度。這樣可能問題並不在selection本身，而是細胞有問題。
→ Ice9: 而且，用1ug/ml 來篩選，壓力太小了，如果tranfect成功，不
→ Ice9: 太可能一開死就死一大票。1ug/ml比較像是maintain時的濃度。
→ blence: 我猜是寫錯了,應該是1mg/ml,就算maintain也至少要50ug/ml
→ blence: 我們MCF7用的是300-500ug/ml這個範圍
推 MDCCLXXVI: 質體的品質ok嗎？濃度有跑膠確定嗎？有時機器測不準
推 chaunen: 推樓上~若質體supercoil的比例低, transfect的比例會大降
→ chaunen: 若表現的是原先MCF7沒有的基因, 跑QPCR會很明顯
推 chaunen: 即使只有少數的細胞有表現
推 chaunen: 可以1.test transfection condition (拿個表現GFP的質體)
→ chaunen: 2.同M大 檢查質體quality(100ng 跑個1% agarose gel)
→ chaunen: 3. 正在select的MCF7如果還沒死光, 就繼續篩(大概2-4周)
→ blence: 其實沒必要探討supercoil與test condition,stable不講求這
→ blence: 些,而是integration,所以才有linearized plasmid for
→ blence: stable transfection的嘗試;transfect再好細胞也是死一堆
推 chaunen: transfection效率高integration 也會比較高吧?
推 chaunen: 跑膠看supercoil的比例只是要驗證這管plasmid的品質,
→ chaunen: 排除gDNA,RNA汙染外,一般來說supercoil比例應該最高
→ chaunen: 比例低則可能已經產生nicked form 並不適合transfection
→ chaunen: B大提到的linearized plasmid是會增加integration沒錯
→ chaunen: 但前提是plasmid DNA 品質好的條件下.
推 chaunen: 除了plasmid品質外,我想transfection condition也蠻重要
→ chaunen: 照原PO的結果來看, 推測transfection效率可能不佳,
→ chaunen: 導致細胞一下子就死光,幾乎沒有細胞撐過transient stage
→ chaunen: 更別說integrate到gemone的比例又更少了...
→ chaunen: 不過我有點好奇, 原PO該不會加到puromycin了吧...
→ chaunen: 以上只是個人看法, 有錯還請指教(抖~)
推 tynse71864: 是說  送進去的是單純的vector嗎  還是有其他的表現pr
推 tynse71864: protein
→ tynse71864: 我之前做tf (用puro）最後大概剩一成吧   還是能挑
→ shinchenboy: 我確定我是加G418 然後篩選濃度我打錯了 是1000ug/ml
→ shinchenboy: 然後我送入空的vector或是有insert外來序列的vector
→ shinchenboy: 一樣在加入G418之後幾乎是死光的狀態 我覺得有可能是
→ shinchenboy: 我transfection的過程就沒有成功 plasmid的品質我會
→ shinchenboy: 跑膠去測試 謝謝各位大大們的建議 小弟感激萬分
→ Ice9: 呃，你應該也要有個没transfect的純細胞當對照吧？
推 tynse71864: 有篇Lonza stable clone的protocol可以參考~
推 ararthur: 1mg/ul可能太強了 還是先titrate濃度再看看吧 而且有些
→ ararthur: 時候是transfect完後先多養兩天再開始Selection 讓他有
→ ararthur: 點時間表現resistant gene 否則即使有transfect進去也會
→ ararthur: 被你掛掉 至於integrated與否 應該是selection後期的事