[求救] PCR定序結果 forward跟reverse完全不同

[polomi (polomi)]

最近利用pUC18做質體的構築，

然後送給定序公司做定序，

而forward的結果是符合預期的結果，

原始檔案AB1的結果除了起頭外，

其餘都是單一的peak。

但是revers的結果大都為雜亂無章的，

也都對不上預期的序列。

主要是使用定序公司提供的primer，

看回收結果forward是M13F(-20)，

revers端則是M13R(-24)。

而詢問定序公司的結果，

則是表示我所需定序的plasmid在revers端有瑕疵的產生?

有送了三次，

因為之前主要都是只看到forward沒問題，

沒仔細再一次revers端是否正確，

三次都是相同的問題。

請問這是代表我的pUC18是有問題的嗎?

還是會有其他原因?

抑或是我的plasmid pUC18有問題嗎?

或是該如何去排除?

先在此感謝大家了~

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→ Ice9: design another forward primer to read through the end…
→ roy047: reverse亂黏, 可重新設計或是同一樓
→ xxtomnyxx: Reverse 的定序 AB1 圖是單一 peak 但是序列都不對嗎？
→ blence: 看起來insert超過1k？
→ supray: 可能你的reverse primer有多個binding site吧? insert中有
→ supray: 相似序列?
→ supray: 同一樓 從已定出的序列設計新primer