Re: [求救] PCR定序結果 forward跟reverse完全不同

[polomi (polomi)]

不好意思，前兩天學校大停電~

整個都呈現無電狀態@@

現在才看到大家的回覆~~


→ Ice9: design another forward primer to read through the end…   07/02 17:46
→ roy047: reverse亂黏, 可重新設計或是同一樓                       07/03 14:54

其實我一開始是先用定序公司提供的序列，

現在已有在設計一段序列使用，

等待重新定序。

→ xxtomnyxx: Reverse 的定序 AB1 圖是單一 peak 但是序列都不對嗎？  07/03 22:09

從revers端去看幾乎都是錯置的，

貼圖一下

http://imgur.com/xMLIa7H,3tmnlfv#1

長度偏短，

且幾乎都是錯置居多。

而forward端

則是http://imgur.com/xMLIa7H,3tmnlfv

長度為1050 bp，

除了前後端外，

幾乎都是單一paek，

而且符合我的預期結果。

→ blence: 看起來insert超過1k？                                    07/04 00:26

送入片段為 1092bp

→ supray: 可能你的reverse primer有多個binding site吧? insert中有  07/04 23:46
→ supray: 相似序列?                                               07/04 23:46

應該是不會

1.      M13F (-40)      5'-CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3'
2.      M13R(-48)       5'-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG-3'
3.      M13F(-20)       5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
4.      M13R(-24)       5'-AAC AGC TAT GAC CAT G-3'

有比對過，

專一性都算滿高的~

→ supray: 同一樓 從已定出的序列設計新primer                       07/04 23:49

恩恩，

希望這次的定序會準一些 QAQ

上次超神挑的，

1/5的機率也能讓我挑到錯誤的位置，

回來比對整個傻眼了。

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→ Ice9: 你兩張圖都一樣啊～ 如果reverse的圖就是那樣，那是肯定没有
→ Ice9: 問題的。要不要拿去 blast genome bank 看是什麼東西？
→ Ice9: 還有，如果所有條件都非常好，其訊是有可能讀到1K以上正確訊
→ Ice9: 號的。我以前曾到到過少少的兩、三次。雖然訊號很弱，但都不
→ Ice9: 會互相干擾。  (我是指1K附近的訊號很弱)
→ polomi: http://imgur.com/ziFsMZL 這是revers的圖
→ Ice9: 看來不是 primer 就是 plasmid 有問題啊。訊號很多……
推 satasumi: revers的primer應該污染了