推 michealking: 可以參考abcam的ripa說明，非常詳細 07/13 00:34
我就是參考abcam的耶 看來還要念熟
推 bu105330: 都用sigma RIPA R0278 抽protein都很多 07/13 01:59
我們家習慣全部bfr都自己泡 嗚
→ Ice9: 如果嫌protein loading 體積太大，可以將要跑的量另存一管後 07/13 07:50
→ Ice9: 在煮蛋白那一步，用不太高的溫度打開蓋子加熱一陣以減少體積 07/13 07:51
→ Ice9: 或是用vacuum dryer減少體積……不過，這樣蛋白不會太多嗎？ 07/13 07:56
→ Ice9: 另外，可有考慮用digitonin取代Triton？ 07/13 07:57
digi不是比tx100更弱的detergent嗎?(印象中) 雖然我看蠻多人做IF會用
家裡也還要找找
→ blence: 如果protein load需要用到80ul,應該換Ab或用IP比較好 07/13 09:17
→ blence: 6well用150ul應該會夠,還是你用on-dish lysis被稀釋掉了? 07/13 09:21
→ blence: 要是量的問題沒解決,別先BCA了,直接sample buffer lysis試 07/13 09:24
Ab應該不太能換 因為是自己lab打兔子來的 (很久以前就在用了
我的80ul大概是80ug (測濃度後加smp bfr的總體積)
主要是我們家不是跑小膠 是大膠 只load 50ug訊號不夠強
我是on-dish lysis 沒錯,但我加lysis bfr前會把plate斜放,把多的PBS吸掉
最後體積跟我加入的bfr是差不多的，稀釋應該不是主因
smp bfr直接lysis我是有聽過,但是不是DNA會全部跑出來 (?)
這樣還能另外加protease inhibtor嗎
→ blence: 我不認為on-dish lysis可以把PBS吸多乾淨,拿空盤試就知道 07/13 18:53
→ blence: 用150 lysis可以回收150,用tube都不見得這麼準,正暗示有多 07/13 18:56
→ blence: 的PBS在維持溼潤阿,這樣150小體積lyse效果不好是必然的 07/13 18:59
→ blence: 提到換Ab是你用oe蛋白訊號卻很差,或許有tag Ab可試 07/13 19:03
→ blence: 若非同細胞在一般transient下操作很正常,你遇到的是系統性 07/13 19:09
→ blence: 問題,純粹是偵測難度高於一般,跟stable clone無關 07/13 19:12
這樣應該先用PBS刮下來後 再用bfr lysis嗎
但刮的動作應該也會讓蠻多細胞破裂的(?)
還是就真的直接用sample buffer (這樣要怎麼定量阿~~
其實也蠻好奇為什麼不用tag的
可能覺得加tag對protein function有影響吧 還要再測試 (我的15kda)
因為現在用的Ab是polyclonal 我的background永遠比訊號強= =
但老闆說沒差就是了
是說斜放的方法好像是b大發文中 下面推文的建議
※ 編輯: tynse71864 (118.168.116.46), 07/14/2015 05:49:54
推 gps0110: on dish lysis 我覺得沒稀釋很多 不過我比較喜歡用urea/s 07/14 17:33
→ gps0110: ds當lysis buffer 07/14 17:33
→ blence: 有沒有稀釋很多自行拿空的dish測試lysis buffer便知 07/14 18:25
→ blence: 原po遇到"150ul不行,500ul才能lyse",如果濃度沒變怎會如此 07/14 18:27
→ tynse71864: 稀釋測試是+5～10ul左右 07/20 15:30