Re: [求救] TA cloning相關問題

[xxtomnyxx (翼天)]

我做 cloning 一向都是用 colony-PCR 挑菌，
到現在從來沒有遇到偽陽性，
有挑到的拿來抽 mini 都是正確的 plasmid。

只要知道為什麼會有偽陽性，
就可以設計適當的 control 來排除偽陽性，
Invitrogen 的 TOPO-TA kit 裡應該會有附 M13 的 forward 和 reverse primer，
這對 primer 就可以拿來做定序或 colony-PCR，
不過我實驗室是拿 T7 和 SP6 來做。

首先，
針對偽陽性的問題，
其實可以推出下面幾種可能：

1. 使用的 primer 是直接放大 insert 序列。
2. 塗菌時有太多的 ligation product 在菌液裡。

可想而知，
一般來說做 ligation 都會加入 vector 約 3~5 倍莫爾濃度的 insert，
所以塗在盤子上的菌液中也許會含有足以被 PCR 放大的 insert 片段，
因此使用的 primer 如果只是針對 insert ，
當然很有可能出現偽陽性。

而第二種可能則是假設接合的效率太好，
塗在盤子上的菌液中有太多 free 的 vector，
這也可能讓 colony-PCR 出現偽陽性。

要排除 colony-PCR 偽陽性的問題，
首先要選擇坐落在 vector 上的 primer，
這樣可以避免 PCR 放大的訊號是來自塗在盤子上的過量的 insert；
再來要避免 ligation 效率太好導致的偽陽性，
只要在挑 colony 做 colony-PCR 的時候準備一個 PCR 組別，
用挑菌的工具(tip, 牙籤或接種環)沾一下盤子上沒有長菌但是有塗到菌液的部分，
可以沾大一點的範圍以增加鑑別度，
用這個當作 colony-PCR 的 template，
這個組別就是 negative control，
如果這個組別有做出 PCR 產物，
那就有必要在挑出的有產物的菌落再做一次 PCR 確定訊號不是來自盤子上的 DNA，
不過如果 negative control 有產物，
但是產物量遠遠低於其他用菌落當 template 的組別，
基本上也不太需要擔心挑到的菌落是偽陽性。

當然，
也需要比對 PCR 產物的大小，
不是只要有產物就是對的菌落。


你雖然說你的 PCR 只有一個主要產物，
但是我想你大概忽略了 primer dimer 的問題了，
Primer dimer 的分子量很低，
只要跑膠有看到一點點，
整個 PCR 產物中的 primer dimer 就有可能是你 insert 的好幾倍莫爾量，
只要 primer dimer 的長度不是 3 的倍數，
一樣會造成 frame shift 使的藍白挑的 colony 呈現白色，
做 TA-cloning 至少要過個 PCR-clean up 的程序把大部分的 primer dimer 去掉，
做 gel-extraction 當然更好不過回收率又是另一個問題了......


Colony-PCR 雖然會多消耗一個 PCR 的工作時間，
但是只要能做好 control 排除偽陽性，
效率絕對比藍白挑或直接養起來抽 mini 來的高上許多。

以我個人來說，
一個理想的 TA-cloning 行程只要 5 天：

Day 1: 早上做 PCR，中午把產物取部分跑膠，
       確定有單一產物後，接著做 PCR-clean up 初步純化產物後，
       接著做 TA-cloning 的 ligation，下午就可以塗菌。

Day 2: 早上起來看菌的狀況，配好 colony-PCR 的 reagent，
       然後挑 colony 並上機做 PCR，
       下午跑膠看結果後，選擇 1~3 個陽性的菌落養在菌液並畫在另一個盤子上。

Day 3: 抽 mini 取得 plasmid。將另一個盤子上的菌送定序確定序列。
       同時將抽出的 mini 切 RE 確定。

Day 4: 冗冗冗～我這裡送菌做定序要兩天。

Day 5: 看定序結果。

其實也可以直接送 Day 3 抽的 mini 去定序，
這樣只要 1 天，Day 4 就能拿到結果，
只是要賭 mini 抽到的 plsamid 的品質。

做 stick-end ligation 可能會多一天切 RE o/n，
不過大致上的流程是一樣的，
給你參考參考。

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.39.94
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1438414458.A.9A7.html
推 gps0110: 推～
→ blence: 我在前面推文指的偽陽性是指colonyPCR negative那些
→ blence: 與其先colonyPCR,何不提高每colony的成功率五到八成以上
→ blence: 讓你每顆都是對的
我個人是覺得他直接拿 PCR 產物連 clean-up 都沒做就是主要的問題。

推 chaunen: cPCR可以拼一次 反正早上收plate到傍晚養小量有足夠時間
→ chaunen: 如果挑48顆(2張24well-gel) 都沒有, 就趕快找原因了.
→ chaunen: 一開始做clone難免一堆troubleshooting 用cPCR比較省時
推 blence: 樓上說的正是我擔心的,應該調整到挑5,6顆就中,而不是放棄
→ blence: troubleshooting,以為靠cPCR就能以海量篩選解決
推 chaunen: 我說的是 troubleshooting完 養小量 抽plasmid來切
推 chaunen: 這樣速度太慢 用cPCR check 能減少很多時間
→ chaunen: 每改完一次condition再來transform 養小量 至少2天吧
→ chaunen: 一次又能養多少管小量? 抽plasmid的時間?
推 chaunen: 照樓上說的第一批沒成功 是不是又要等兩天?
推 chaunen: 如果有篩到 就能趕快往下做 沒有也能趕快troubleshooting
對一個新手來說，
我也是覺得一開始先讓他用 cPCR 篩，
之後實驗再讓他慢慢去改進提升成功率。

簡單的說，
對一個大學部的學生就算了，
他真的只是來學東西的，
但是如果是碩士、博士生或是助理，
我只能說你在實驗室是要做出成果的，
除非「如何攘 cloning 成功率從 10% 進步到 90%」能當畢業論文，
不然其實沒那麼多資源(時間)給你先練好技術再往下做。
※ 編輯: xxtomnyxx (120.126.39.94), 08/01/2015 20:41:02
推 lail: 請問colonr PCR遇到偽陰性的機會高嗎？身邊有人colony PCR沒
→ lail: 有產物，但抽完mini後卻發現菌是對的…
有可能會遇到，
例如 insert 的序列是 GC-rich 或是會影響 cPCR 的 primer binding，
都會造成 cPCR 沒有產物，
這的確是 cPCR 的一個部小的缺點。
※ 編輯: xxtomnyxx (120.126.39.94), 08/02/2015 16:29:29