[求救] 斑馬魚成魚臟器RNA萃取

[myelroy (阿砲)]

請問各位RNA神人們QQ
我近來需要萃取斑馬魚成魚胰臟進行Q-PCR的基因表現量定量實驗
所以理論上RNA的品質不可以太糟
而我們實驗室之前都只有在萃取斑馬魚胚胎的total RNA，而我已經有爬過文，
並且問過估狗大神怎麼抽斑馬魚的胰臟RNA了，可是沒有找到適合的方法

目前我使用的方法是:

(取sample)
1.把成魚用低溫使其凍暈/死
2.利用水震盪過的鑷子以及剪刀將成魚從洩殖腔往前往上剪開
3.把魚皮剝掉後去除卵巢/精囊
4.把腸道上覆蓋的肝臟去除
5.把腸系膜剝除(斑馬魚胰臟分布位置)

(RNA萃取)
1.把取出的樣品加入600ul Trizol用研磨棒磨碎
2.用24G的針頭來回抽取數次確認樣品非常的碎
3.再加入600ul Trizol
4.加入250ul chloroform
5.用votex的方法震盪到混和液是草莓牛奶的顏色
6.離心13500rpm,30min,4度C
7.抽取上清液到新的1.5cc tube
8.加入上清液一半體積的酸phenol，輕微搖晃混合靜置5min
9.加入和phenol等體積的chloroform混和均勻
10.離心13500rpm,30min,4度C (重複step7-10一次)
11.抽取上清液
12.加入1/2體積的salt(1.2M sodium Chloride, 0.8M Sodium Citrate)
和1/2體積的2-propanol
13.-20度C沉降20分鐘
14.離心13500rpm,20min,4度C
15.75%DEPC-EtOH wash pellet
16.抽風櫃中air dry
17.40ul DEPC-DDW回溶(60度C)

(結果)
                  con.(ng/ul)     260/280
pancreas RNA         1861           2.1
4dpf embryo          1369           2.1

RNA膠圖  http://imgur.com/ZjUJMwK


以上謝謝大家

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→ a90648: 為什麼要做8~11的步驟阿?
推 chaunen: 對阿 不是上清液加等量isopropanol然後離心沉澱RNA嗎@@?
→ myelroy: 不做做8-11嗎? 因為Trizol/chrolform完介面層還是會有白
→ myelroy: 白的東西 那些不是DNA汙染嗎?所以我們實驗室都會再用
→ myelroy: 酸phenol過個一兩次，確定沒由白色絲狀物
→ a90648: 那個白色不是汙染而是本來就會有的東西
→ a90648: http://0rz.tw/AP5Rk protocol有寫!!
推 chaunen: 那個不就主要是變性的protein嗎?還幫你隔開上下層 超貼心
→ myelroy: 蝦咪!!謝謝各位的指正 那請問我取樣品的方式有錯嗎??
推 chaunen: 我有點好奇24G針頭來回抽吸gDNA會不會斷? 請樓下大大解惑
→ a90648: 斷了應該也沒差啦!! XD 有沒有錯主要看你上清取多少囉
推 chaunen: 更正一下, 由於trizol是酸性,使得DNA會沉澱於interphase
→ chaunen: (離心後), 所以白色那層應該是protein/gDNA.
→ Ice9: 多餘的步驟可以去掉。另外，步驟3/4之間和5/6之間，我家習慣
→ Ice9: 放置一段時間，大約是5mins @ RT。在弄乾時，RNA 不要全乾，
→ Ice9: 否則很不好回溶。對了，你 phenol 有另外調 pH 值嗎？
→ Ice9: 還有，你的步驟12和一般用法不同，有什麼依據嗎？
→ myelroy: 回I大我沒有另外調整phenol的PH值耶~我們都直接買PH4.5
→ myelroy: 回a大我的上清液大概都會取500ul
→ myelroy: 步驟12會用salt其實我不確定真正的原因，可是我去查有說
→ myelroy: 法是鹽類可以幫助RNA析出，而且在萃取胚胎的RNA用我們的
→ myelroy: protocol可以在室溫完成全部的步驟
→ blence: 我猜問步驟12不是要問用salt的原因,而是配方的依據何來?
→ a90648: 用Trizol本來就可以在室溫操作啦!!XD
→ a90648: 因為你的步驟加了很多Trizol protocol裡沒有的步驟
→ a90648: 我也很好奇這些步驟的來源是什麼，會問你上清取多少
→ a90648: 主要就是要避免取到白色那層，取500ul很安全啦!!
→ myelroy: to a大 其實那是我老闆之前modify出來的protocol 我今天
→ myelroy: 有分別用兩個方法抽了斑馬魚的胰臟 並跑了RNA膠 如付圖
→ myelroy: http://i.imgur.com/6hp6sj8.jpg
→ myelroy: 第一二條是我們實驗室的 第三條是trizol method 我現在很
→ myelroy: 疑惑為什麼28s那麼暗 是因為dye嗎？
→ Ice9: 我查了一下，你們的方法似乎是從1987年Chomczynske & Sacchi
→ Ice9: modified來的，網路上也一堆類似的方法。28S RNA 是被Xylene
→ Ice9: Cyanol 遮住没錯。下次可以減少dye的配量，或是改變 gel 的
→ Ice9: percentage。
推 michealking: 斑馬魚臟器夠小 直接塞trio 然後照步驟做就好