[求救] western 轉漬效果差?

[grassshan (紙飛機啊歐歐踢欸死)]

細胞種類:分化9天完成的3T3-L1細胞
Protein Loading 量: 100ug
抗體: C/EBP alpha、PPARgamma (Stant Cruz.)

我最近在測試抗體比例，先抓了100ug的最大Protein量去測試

但低到1:200的比例出來都是白片，
重新Hy actin 卻是有東西的(但Band沒有很粗)


我後續有查膠染coomasin blue
membrane 染Ponceau S

結果如下:

http://imgur.com/fTjXYbb,wC4sj4c#1

http://imgur.com/fTjXYbb,wC4sj4c#0



之前因為轉漬效果不好，
(之前使用200mA 2hr 埋冰放在4度C冰箱中)

有跟老師討論改在中間放個磁石,
然後包埋冰的情況下 室溫 200mA 2hr

但這結果看來，是不是依舊轉漬效果差呢?...

我有試著將電壓上調到300mA
但我們家電壓器好像上不去,一直顯示Error
我加了半個小時的轉漬時間,但還是不是很妙．．．


想請問各位大大～
還有什麼改善的方法呢？


此外,ECL 我們家使用的牌子是Thrmo的
看protocol 顯影時間3min
但我照完一次冷光,想橋位置直接重新照的時候,就又是一片白了@_@
(過程大概5分鐘內)

這樣要照是再用ECL反應一次嗎?

我有聽說反應太久會燒片  還是白片？

但我現在寧願燒片也不想要再看白片了..


然後有需要補充的地方，歡迎大大指教>_<

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→ grassshan: C/EBP alpha分子量37.5 PPARgamma分子量52
→ felix0330: 下次加跑 marker，看起來不像 100ug protein 的量，可
→ felix0330: 能蛋白質定量有問題
→ grassshan: 是多跑幾條marker的意思嗎@_@?
推 tynse71864: 轉漬看起來蠻正常的耶  我家也4度轉
→ tynse71864: 可能是lysate處理的問題 （？
推 lyu0001: 1A  1hr
→ alex53001: transfer buffer要不要交叉試試看(換別家or重配） memb
→ alex53001: rane是什麼? 是不是PVDF然後沒泡MeOH 依我的經驗 200mA
→ alex53001: ,2hr對於你這個分子量很ok