[求救] western 壓片背景值太高

[blueness1225 (押比)]

麻煩各位幫忙trouble shooting!!!

已爬過之前的文章，也嘗試之前的方法，但我western壓片結果還是很髒！

樣品為小鼠肝臟 protein loading量為40ug 體積10-15uL

running條件上膠60V 下膠80V 室溫

transfer(濕式)條件為400mA 120min 埋冰 使用0.45孔徑PVDF

blocking為Genetex blocking buffer 使用前回到室溫後再blocking 30min

wash是使用Millipore SNAP i.d.2 http://imgur.com/1Acr2hv 將TBST倒入方格中wash

一抗1:1000 4度C overnight (MMP-9為Cell signaling MMP-2為St John's Laboratory)

二抗1:10000 室溫 10min (Genetex rabbit)

ECL為Millipore 瀝掉多餘的ECL後再去暗房壓片

壓片為傳統手洗壓片

其中配制電泳膠的溶液全部都已經重新配過，上膠下膠ph值皆正常(上：6.8，下：8.8)


壓片結果圖
http://imgur.com/vM127W2

http://imgur.com/TqagQqc

lane的痕跡非常明顯，定量會有困難。

再麻煩大家幫忙了!!!萬分感謝!!!!!!!!

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推 tynse71864: block改1hr?
→ tynse71864: 然後1抗dilute在blocking bfr裡
推 tynse71864: 另外genetex bfr是哪個啊？ 1%BSA還是5%牛奶
→ tynse71864: 前者會比較髒一點
→ blueness1225: blocking 改1hr 但還是一樣QQ
→ blueness1225: Blocking buffer 是genetex commercial 的產品~不是
→ blueness1225: BSA也不是牛奶~~
→ blueness1225: 謝謝你幫忙！請問還有哪裡可以改進嗎?
→ blence: 是用SNAP id2,為什麼protocol不像它號稱的時間跟步驟?
→ blence: 會問你是用可能比較髒的BSA或milk,應該是需要考慮換一下
→ blence: blocking bf,還是已經買了commerical就只能改blockin時間?
→ blueness1225: 因為之前用SNAP id2 建議的下去做，但壓片時間會拉
→ blueness1225: 長非常久（20min以上），又抗體一定要溶在0.5%milk
→ blueness1225:  in TBST，可是壓出來的band好像沒有比溶在的5%BSA
→ blueness1225: 那麼清楚，所以就還是ㄧ抗in BSA overnight 。block
→ blueness1225: ing buffer 的話是已經買了，前一陣子壓出來的都乾
→ blueness1225: 淨清楚，這次就突然都一直出現明顯的lane，才想說
→ blueness1225: 請大家幫忙看看可能還有哪些問題我沒想到的，可以再
→ blueness1225: 做改進！
→ blueness1225: 也再想說是否要改回使用milk blocking會不會比較好
→ vetvet: 換一支純化過的二抗，應該會有幫助改善
→ blueness1225: 請問V大 純化過的二抗是指什麼啊？？？
推 gary910729: 試試用tritonx100 0.3或0.5% 背景比較低 但signal也會
→ gary910729: 相對低 還有試試preabsorbed的一抗
→ vetvet: 你仔細看二抗，有的會標示辯識的Ig部位，我之前發現過
→ vetvet: 同樣抗mouse的二抗，H+L/L/H/Fab 這幾種呈現的背景會有差
→ vetvet: 在做ELISA的時候更明顯
→ vetvet: 另外，在抗體的data sheet上通常也會說明是否經過純化
→ vetvet: 你先看一下目前在用的二抗是什麼，再挑另一支其他的用用看
→ blueness1225: 謝謝大家!!!我再試試看!!!