[求救] 有關primary RPE cell培養問題想請教

[flyinrainday (小辮子)]

各位前輩您們好，上PTT很久了但因為不熟悉一些指令操作所以不常發言，格式上如果有
錯誤還請見諒！

回到我的問題，今年接到一個實驗是要將倉鼠的RPE細胞分離出來做primary cell
culture，之後要做一些treatment再看幾個蛋白質表現狀況還有RNA量。

經過一兩個月我已經可以分離培養RPE primary cell並完成蛋白質WB部分，當時有將分出
來的約三~四代的細胞放大凍管，因為手邊有其他工作暫時停下了一兩個月，當我重新開
始實驗，解凍細胞開始養兩三天，我發現它生長速度變慢，而且隨時間細胞跟細胞間的界
線開始變的不明顯，一些較分散的細胞開始擴張變得很大顆然後停止生長，感覺就是貼得
非常平，這些細胞用TE打下來繼代還是會再貼，但型態就都是跟剛剛說的一樣，還有一點
就是TE較難打下來，打下來的細胞大小不均勻形狀也不一。這根本沒辦法做實驗。

邪門的是，我用同樣方法再取RPE cell重新做primary cell culture，由組織發散出來的
細胞都很漂亮，生長旺盛，但當我用TE切下來做繼代之後兩三天，型態又開始改變，重複
做了幾次都一樣。

我先大致說一下我的方法：
1. 分離HM RPE layer
2. 2 u/ml dispase處理10 min, 37度
3. TE處理10 min, 37度
4. 以20% FCS的DMEM/F12停止，1200 rpm spindown後以20% FCS, 1% A.A.以及50 ug/ml
   gentamycin的DMEM/F12培養，組織上方我還會蓋一片蓋玻片幫助貼附。

正常來說，每兩天換一次medium，換到第三次再過兩天，6cm dish會長大概六成，這時我
會做第一次繼代，換成10cm dish，並把組織與玻片給去掉避免影響細胞生長，之後換成
10% FCS, 1% A.A.的DMEM/F12繼續放大到第三代就夠我做實驗。
但當我重新開始做這個實驗之後往往在第一次繼代之後細胞型態就變了，屢試不爽，一隻
隻小倉鼠一次次失敗，總覺得很對不起牠們壓力很大。

想請各位前輩檢視一下我過程有沒有遺漏或不恰當的地方，我後來有修改幾種實驗方式：
1. 改用全F12 medium
2. dispase改處理90分鐘，不使用TE(這是根據paper的方法)
3. 減半抗生素A.A.與gentamycin用量
4. FCS改用inactive過的

以上全部無效，拜託各位前輩，我身後已經跟了一堆透明小白球了...
感激不盡！


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推 lail: primary cell好像都有這種問題，我是做mouse ADSC，現在就是
→ lail: 不凍細胞，細胞一分好養好就全部做實驗
推 ed791214: 養好全部做實驗＋1 RPE的 proliferation能力很差而且
→ ed791214: hexagonal morphology要細胞密度很高才會形成
推 ed791214: 讓細胞慢慢長～長到它的密度夠高就應該會有型態了
→ flyinrainday: 恩，我新的一批就是6well全養，不用TE切了，結果細
→ flyinrainday: 胞數太少，RNA抽出來量不夠做QPCR =   ="
推 melanoma: 細胞型態變化聽起來像被汙染了