[求救] IHC 冷凍切片 染不出 PCNA

[swwy1661 (小玉米)]

各位大大好,小弟是IHC新手 所以目前有遇到問題,希望大大們可以提供意見和協助

實驗流程如下

sacrifice 斑馬魚取出brain
↓
4% PFA fix O/N
↓
隔天取出,泡在OCT一小時
↓
OCT包埋
↓
-20度冷凍切片(12um)
↓
將slide,放37°c烘箱，OCT烘乾後取出
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
PBST(1% triton X-100) RT 1hr
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
blocking RT 1hr (blocking buffer成分 100λ 1X PBS　0.003 BSA　2λgoat serum)
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
一抗PCNA 1:50 4°c O/N
↓
PBS wash 10 mins *3
↓
二抗(488) 1:200 RT 2hr  (避光)
↓
螢光顯微鏡

狀況:PCNA染不出來,在螢光顯微鏡下沒有顯示,之前有上過cofocal也是一樣

問題:
1.目前固定斑馬魚腦組織的部分,只有用PFA O/N
  沒有使用10%~30%蔗糖溶液梯度脫水,是否對於IHC染色有影響?

2.blocking buffer成分部分,看過其他protocol是使用maleic acid
  而不是用PBS,不知道是不是因blocking不好,所以導致PCNA染不上?

麻煩各位大大,幫忙一下,看一下實驗流程有無錯誤,或者給晚輩一點建議,謝謝了

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.114.100.188
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1441781259.A.72E.html
推 michealking: PCNA哪家的？
→ swwy1661: 是Santa Cruz 的
推 jabari: ..聖誕老公公的抗體啊... 原po籤運不好..
推 johanjohan: 沒retrieval
→ Ice9: 剛過三伏，未到三九啊，季節不對 XDD 有測試過抗體了嗎？
推 michealking: 建議改anaspec 或Genetex 換之前測一下抗體
推 kg9101266: Santa的抗體換個lot有時效果就差很多，不過業務都滿給
→ kg9101266: 換的，試試吧
→ bioaspen: 冷凍切片完有先HE染色嗎 沒使用梯度脫水有時會造成細胞
→ bioaspen: 核損而無法染出 建議先試試
推 haoen: 有用PFA沒retrival…你覺得做得出？