[求救] 細胞表面接受器偵測

[kgwu (徵5/2 獅象戰內野優待票)]

最近在做肝癌細胞表面蛋白偵測

使用流式細胞儀來進行偵測

希望細胞在加藥處理後，細胞表面的接受器會增加

目前到的問題是:

實驗已經進行3次以上，但是結果並不穩定

有時會增加，有時沒有變化

有時control的值在不同次的實驗中，飄移(增加)有點多


因為已經有另一實驗結果可佐證表面接受器有增加的情況

所以我認為FLOW做出來的DATA應該也會增加才是


我的實驗步驟為:

1. 細胞seeding 24小時後，加藥處理
2. 加藥24小時後，收集細胞，上機

收集細胞步驟:

1.PBS wash細胞，利用trypsin將細胞切下，收集於離心管中

2.離心後，移除上清液，利用含有1% FBS的PBS沖洗細胞，離心 (此步驟進行兩次)

3.移除上清液，用含有1% FBS的PBS沖散細胞，靜置於冰上20分鐘

4.離心，用PBS將細胞打散，加入抗體，避光並靜置於冰上45分鐘

5.離心，移除上清液，用PBS沖洗細胞 (此步驟進行兩次)

6.離心，移除上清液，加入適量的PBS沖散細胞，上機


不知步驟是否有可改進之處? 或是有其他可改善的方法?

請各位版友不吝指教~感謝!






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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1441786633.A.E74.html
→ Ice9: 會不會是 trypsinize 的步驟造成。要不要把這一步的條件詳述
→ Ice9: 一下？另外，可以參考版友aaaazzzz的那一篇及討論串內容。
→ kgwu: 細胞是seeding在6 cm dish, trypsin 是剛從冰箱拿出來
→ kgwu: 的，加入200ul的冰冷trypsin,將細胞放入37度培養箱三
→ kgwu: 分鐘，用medium將細胞沖下，收集於離心管中
→ milkpa: 都要看表面蛋白質了，就別用trypsin，改用2％EDTA之類
→ kgwu: 感謝建議
→ aaaazzzz: 我先前看膜蛋白也用trypsin，請教這樣會有什麼樣的影響?
→ aaaazzzz: 附帶一問，我用trypsin打下癌細胞後，去跑flow，會發現
推 aaaazzzz: 細胞變得非常黏稠，黏稠程度甚至形成團塊,吸起來還會黏
→ aaaazzzz: 在塑膠tip上，不曉得和trypsin使用過長的時間有關？
推 ChesterYeah: 打太久、細胞太濃、trysin太濃