[求救] colony PCR後細菌長不出來

[shinchenboy (欣承男孩)]

我幫我朋友問的

最近在做cloning

construct(vector+insert約13000bp) 完成後

transform到E coli中 然後於LB agar塗盤

37度培養12h後收菌

發現細菌有長(clone顆粒分明)

挑了其中10顆做colony PCR

方法是先用tip沾 然後再PCR tube內晃個幾圈(此時裡面已有加酵素)

最後再把tip置入養菌小館

PCR的結果發現其中有幾管有insert進去

我們把有insert進去的clone拿去37度培養12h

結果發現細菌沒有長出來

後來我們覺得會不會是細菌量太少

所已換了另一種方式

在挑clone時我們用tip把挑到的clone先點在新的LB agar plate上

把它拿去37度培養12h

同時做colony PCR

我們預計把有成功insert進去的clone再拿去液態LB broth中擴增

結果發現點在新的plate上的clone變好大顆

然後挑了有成功的clone繼續於液態LB broth中培養

結果細菌仍然長不出來

我們把LB broth換成TB broth仍然長不出來

我朋友已經做了好多次都長不出來(明明agar上的clone很明顯)

想請問版上各位大大有沒有遇過類似的情況

感激不盡~










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推 jsi: construct較大的時候可能會發生，insert被踢掉，可改換其他的
→ jsi: vector.
→ blence: 13k,在37度培養12h的clone在agar plate應該不會很明顯吧
→ Ice9: 有加抗生素？
→ roy047: 養菌管有搖晃嗎？...或者是封太緊沒空氣？
→ ararthur: 養overnight吧
推 aceliang: colony挑到LB broth搖，兩小時取一滴滴colony PCR
→ aceliang: 同一管隔天應該就可以收割了 是否？
→ patricksky: 養久點  我曾經類似狀況有養到兩夜之久
→ patricksky: 然後 養出的菌和質體還是要反覆測試是否正確
→ roy047: 還有想到一個 要確定抗生素濃度正確
推 Peetu: 篩選的方法?? 抗生素也有分很多種，抗藥機制不同會影響
→ Peetu: 培養的時間