[求救] 細胞免疫螢光isotype control很明顯

[dnye (缺少勇氣..)]

最近在做細胞免疫螢光,

主要是要染膜上的蛋白質,

一抗是Mouse / IgG2b, kappa

二抗則是rabbit antimouse igG接 Alexa Fluor® 488

因此我的ISOTYPE CONTROL就選擇Mouse / IgG2b, kappa,

但是結果出來Isotype control的螢光很明顯,尤其是在核的部分,

我的步驟是先做固定,染一抗,

染完一抗再用triton 100作permeabilization,

之後以4%BSA做BLOCKING,接著染二抗約一到兩小時,

不知道是為什麼結果出來Isotype control的螢光很明顯,尤其是在核的部分,

請各位大大指導一下,

謝謝



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→ tharaohfu: sample是細胞?組織切片?
→ tharaohfu: 染膜蛋白也不一定要用到Triton  固定完直接blocking
→ dnye: 是細胞,因為最後有用Hoest33258染核,所以才加triton
→ tharaohfu: 一抗1hr+二抗0.5hr即可(室溫之下)
→ lail: 換別種fix solution?
→ dnye: 我是用4%的PFA當固定液，可以改什麼當固定液？謝謝
→ dnye: 好，我試試二抗放0.5hr
→ lail: 其他細胞染這隻抗體也會這樣嗎？（一樣是你操作的狀況下）；
→ lail: 換隻二抗如何？
→ lail: fix solution網路上找找就有，如methanol，但似乎不適用於
→ lail: 膜蛋白的染色
→ dnye: 我只有這隻細胞，我試試別只二抗看看
推 tharaohfu: PFA固定染螢光易有background 建議換固定buffer
→ tharaohfu: -20度C的methanol或是acetone都可以
→ dnye: 好,我下次試試看,感謝大家,做完再來跟大家報告結果!
推 tynse71864: 我會在1抗前permeablize耶
→ tynse71864: 另外IgG可以，但不是最好的ctrl, 核內超強訊號不可避
→ tynse71864: ，很難去調整你的laser強度
→ tynse71864: 你的膜上蛋白是endogeneous還是外送的呢？
→ tynse71864: 若是後者，可用無外送的細胞當ctrl,其次是用IgG,或只
→ tynse71864: 下二抗做對照
→ tynse71864: 染核我記得只要fix就可以了吧
→ tynse71864: PFA易有background,可在blocking時輔以0.2M的glycine,
→ tynse71864: 可避免殘留的醛基對後續實驗的影響
→ tynse71864: 洗的時間拉長也可（我是10min*3次
→ lail: 我以前染核蛋白用aceton固定即可
→ dnye: 各位大大，我今天加一個單獨二抗，結果背景蠻明顯，所以二
→ dnye: 抗有問題
→ Ice9: 所以你的實驗組呢，細胞核没訊號嗎？
→ dnye: 實驗組也是有訊號的，只是只加二抗的背景值就已經很高了