[求救] qPCR做不出做不出預期結果?

[hachibuya (黃金騎士 牙狼)]

我實驗室在測某種藥物加到癌細胞後和放射線治療的關係

藥物的廠商有幫我們做DNA的microarray

跑出來後蛋白質fibronectin有很明顯如預期的差異
(沒加藥global normalization為428, 加了藥的降到215)

因為只有microarry的data感覺很虛

所以老師說用realtime qPCR跑看看

我們的機器是Roche的LightCycler Nano

一開始是用SYBR GREEN染, 對照組是用18S

結果不同時間養的細胞做出來的結果很不一
(對照組和加藥組間的結果很不穩定 有時算出來是對照組高 有時加藥組高
但相同sample做duplicate或triplicate是沒問題的)

甚至連相同的cDNA sample放了一周後也無法做出一樣的結果

後來另一個老師說這可能還是手的問題

建議我用hydrolysis probe 可以同一個sample裡染不同的cDNA

照了建議重新設計買了primer和probe

還有universal probelibrary GADPH的primer和probe

結果是可以在同smaple同時做出兩種基因的表現

但Cq值的relative 定量計算結果還是亂七八糟的

怎麼做都做不出microarry的結果

上網查了一下好像也沒有定論說microarry和qPCR的結果一定會一樣或不同

因為我不是生科本行出生的  不知道各為大大怎麼看?


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※ 編輯: hachibuya (133.87.71.254), 11/25/2015 16:38:03
※ 編輯: hachibuya (133.87.71.254), 11/25/2015 16:38:45
推 jabari: DNA microarray??
→ hachibuya: 對
→ blence: DNA array有變化為什麼是去看RNA？
推 aggaci: 應該是cDNA array
推 lelojack: 一般來說 qPCR是黃金標準 array的結果要做重複 才可能
→ lelojack: 不用qPCR驗證
推 lelojack: 我覺得你應該要相信qPCR三重複的數據
推 lelojack: 我以前分析array. 不同的型號array 同樣的probe 數據
→ lelojack:   據我口委的說法 是不能整合在一起
推 lelojack: U133A的數據不能跟U133plus2的數據一起比較
推 lelojack: 而論文有提過 array低表達的基因訊號不準  建議你看一下
→ lelojack: 整體數據 可能數值兩百算低表達的
推 michealking: CP數據貼上來看一下，然後你的RNA quality如何
→ michealking: 翻的kit 用的濃度都找到一個標準的方法做
→ michealking: 然後你以前有做過qPCR嗎?沒有跟一個做過的一起做一次
推 lail: 送array的sample還有嗎？拿那個sample來做，看跟array的結果
→ lail: 是否相同
推 notmyself: 三重覆 是指三個sample 各抽RNA跑
→ notmyself: 還是同一個cDNA load 3個well
→ hachibuya: 同一cDNA跑三個well
推 allisa: qPCR其實滿準的又很靈敏，如果你同一管cDNA做的重覆數值
→ allisa: 差到0.1 就是你做的不準確 要不要請會做的人帶你做一次?
→ allisa: 同一管cDNA之後要再跑之前有沒有確實vortex and spin down