推 microball: 你可以解釋一下 insert 兩端的細節嗎? 11/26 13:29
→ microball: PCR 產物預留2bp 有時候RE 的效率很低，有點危險 11/26 13:30
→ Ice9: 你 PCR 產物有做 RE 切割嗎？ 11/26 22:03
→ Ice9: 還有，PCR產物切個o/n可以理解，但是你vector切這麼久幹嘛？ 11/26 22:04
Cloning 相關問題
Vector為10K , RE 相距 9bp, 分別為 SNABI 及 NHEI (Sticky end and blunt end)
NEB, smart buffer 取vector 1ug同時切兩刀 o/n
Insert 是chromosome PCR product 約 1.1K, 有major band , 而Primer有各預留 2bp 及 6bp.
跑完0.8%膠, 後進行clean up
利用NEB Quick ligation (Molar ratio: 1:7) 10 mins
Transformation on ice 20 mins, heat shock 42度 45秒, on ice 5 mins
Add S.O.C medium 500ul and incubation 1h 37度
取 200ul 塗盤
失敗…已經試很多次
沒有任何中繼站 可以進行Check, vector 切完 也看不出來
Ligation完 10K->11K 也很難看得出來
不知道有沒有高手使用過這兩種RE????或是可以給點建議
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