[求救] 膠體純化的回收率低

[yoyukiyo (Green)]

最近在做cloing
要將1k左右的片段接到vector上

目前的做法是切10ug的insert
跑膠分離後切下要的片段進行膠體純化
然後我是用GeneMark的kit

目前是一直卡在elute後的O.D值都很低
回溶的體積為25-30ul
但是O.D大概都在20-30ng/ul間

雖然這樣算一算濃度還有將近1ug
但是後續還要進行blunting
表示前面的濃度要高一點
才可以繼續後面的純化...

想請問大家要怎麼提高kit的回收率呀QQ

廠商都標榜回收率將近90%
怎麼我反而是相反= ='''





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推 puddinggg: 10ug去切是指total 10ug嗎？如果vector5k，這樣你原始1
→ puddinggg: 0ug切出來完全不lost insert也只有2ug而已
→ hitmd: 膠體純化我覺得用kit很看臉，不同品牌在不同實驗室都有不一
→ hitmd: 樣的效率
推 patricksky: 量很夠了吧?  你總量要下多少做transformation?
推 patricksky: 通常vector+insert約1ug  就有clone可以挑了
→ yoyukiyo: 是total取10ug去digestion 然後全下跑膠
→ yoyukiyo: 我是用學姐的純化方法 然後同樣的kit 學姐就說沒純化這
→ yoyukiyo: 麼少= ='''
→ yoyukiyo: 因為後續還要用pfu polymerase做blunting 然後再純化一
→ yoyukiyo: 次 所以擔心目前的濃度不夠(椅稻･`)
→ blence: 你沒有回答到1樓問的10ul是哪裡來,這才是關鍵
→ blence:                    10ug
→ blence: 既然可以知道10ug,想必來源不是PCR產物,而是plasmid這類
→ blence: 既然如此,直接用pfu從plasmid以PCR放大,這會不會更方便?
→ untilnow: 一塊膠不夠,你怎麼不切兩塊
→ Ice9: 要是你的原始plasmid是9K以上，那切下來是那個量很正常啊。
→ Ice9: 把那一管水份蒸發一下，就會變濃了。你的blunting是用Klenow
→ Ice9: 嗎？對了，片段補平之前，不太建議跑膠純化。
→ Ice9: 還有，你寫到「一直卡」……那表示做了很多吧。可以全弄成同
→ Ice9: 一管再將水蒸發一下，那不就會有更多更濃的insert了？
推 tony51501: 我覺得20～30ng蠻高的了，我做的insert 1.2kb左右 vect
→ tony51501: or 5kb左右，都是從膠上萃下來，之後ligation也成功
→ tony51501: 回溶體積32ul
推 tynse71864: 濃度低沒關係 還是丟丟看 ligation 機率好中了就中了
→ tynse71864: xd
→ tynse71864: 死馬當活馬醫 ligation最後要求要10ul我30還是有成功
→ tynse71864: xd
→ tynse71864: 另外水可以蒸乾或濃縮
推 ABULA666: 廠商給的回收率看看就好了...基本上抽不同大小的片段
→ ABULA666: 回收率都部會不太一樣，決定回收的效率主要就是看品牌，
→ ABULA666: 如果是品質差的牌子怎麼抽都不會好，再來就看你的目標
→ ABULA666: 片段多大，人為的差異...我想就一些小技巧可以彌補吧?
→ ABULA666: 但決定性沒有像牌子那麼重要
推 tynse71864: 大象牌5-7成我覺得差不多
推 jimmy80727: 回收少沒關係阿　ligation照作中了就是你的