[求救] 牛鞏膜細胞primary culture

[PumpkinHead (PumpkinHead)]

各位大大好，小妹因為實驗需要進行牛鞏膜細胞的primary culture
因為實驗室裡沒有人做過同樣的實驗，所以一直以來小妹都在摸索
不過結果一直不是很理想，想請問各位大大是不是有相關的經驗可以分享，拜託拜託><
小妹感激不盡~~~

以下是小妹的protocol:
1.準備需處理用器械及容器，清潔並滅菌完成
2.取2個500ml大燒杯(已滅菌)，一個放優碘，一個放PBS+0.05%EDTA
3.將眼球周圍的肉去掉，倒入優碘，浸泡5min
4.在hood裡準備3個dish，將PBS+EDTA倒入燒杯及dish中
5.將眼球移到hood中，浸泡在PBS+EDTA中洗掉優碘
6.用手術刀於角膜上劃一刀，剪下角膜及鞏膜
7.一邊用scraper刮除視網膜及脈絡叢，一邊用PBS+EDTA清洗鞏膜，重複3次
8.浸泡於Dispase II(0.8U)+DMEM(含抗生素，不含血清)，4度C，overnight
9.取出鞏膜，用PBS+EDTA洗三次，同時用scraper刮鞏膜表面
10.剪碎鞏膜，之後用PBS+EDTA wash X3
11.將組織碎塊浸泡於collagenase type II(4mg/ml)+DMEM(含血清)中，37度C，5%CO2
   2hr
12.用PBS+EDTA清洗，過濾




若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

           ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.137.85
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推 caesar0926: 做過小鼠角膜的，medium很重要，你的問題在哪??
過濾之後細胞數不多，甚至沒有，不過在digest過程中，顯微鏡下有看到細胞黏在組織上
過濾前我也有稍微pipet一下

※ 編輯: PumpkinHead (1.160.39.194), 01/02/2016 16:42:37
※ 編輯: PumpkinHead (1.160.39.194), 01/02/2016 16:46:39
推 LIAR: 細胞名稱是什麼？
Bovine scleral fibroblast
推 LIAR: http://www.molvis.org/molvis/v21/138/
→ LIAR: 這邊只用一小時。有的protocol有強調細胞混很脆弱，所以分兩
→ LIAR: 段，先一小時收一次，再繼續處裡剩下的到4小時。
推 LIAR: https://tinyurl.com/zbwzkgz
推 caesar0926: 之前沒有過濾的步驟，不知道用意是什麼??
因為digest過後還是會有組織碎塊，所以會過濾，將剩下的組織塊過濾掉
推 caesar0926: 還有一個問題你把眼睛浸優點嗎??當初我分小鼠角膜細胞
→ caesar0926: 時，是用泡PBS+抗生素去避免汙染
我有做過角膜的fibroblast，也是泡優點，所以這方法應該是可行的
→ caesar0926: 優點我過分keratinocyte的前輩用過..不過他是用尾巴
→ caesar0926: 是不清楚眼睛這樣可不可以...
推 LIAR: 我角膜內皮也是優碘，不過畢竟內皮比較乾淨，加上有人認為
→ LIAR: 優點要乾掉才有用，所以我也不確定這到底有沒有用
※ 編輯: PumpkinHead (140.112.137.71), 01/04/2016 13:39:42