[求救] Culture medium western

[tynse71864 (TATA box)]

大家好

我的實驗想看在culture medium (10%FBS) 裡

overexpress的 target protein 有多少被secret出來

因此目前的做法是

直接收mediumm，loading 約1/500下去做western


western壓的到我要看的protein(16~17kda) 但是極醜....

http://0rz.tw/UMKNU

由於medium中有很多BSA / IgG / lipid雜七雜八的東西

所以跑的時候會大扭曲


目前沒有考慮做elisa (因為secretion的量很多

抗體也無法做IP

因此想知道有無方法 可以處理這樣子的sample

讓western不會跑歪


目前有想到的方法是:

1.Dilute sample，取更少的量

(但因為之後要做endogenous，我怕之後此方法會不能用


2.加一些detergent進去 (?) 如SDS


查過的paper都只有寫 load medium，不太會寫怎麼處理


想問有無類似經驗的版友們可以分享經驗呢?

謝謝!



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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1452316024.A.281.html
→ tynse71864: 順問一下，縮網址這樣子OK嗎 (?)
推 rasaze: 為什麼量大就不做ELISA?
→ tynse71864: 抗體是自己打的 也不確定能不能做 ELISA
→ tynse71864: WB相對簡單
→ xxtomnyxx: Cell line 是什麼？如果是 HEK293 可以試試用 CD293
→ xxtomnyxx: medium，只是有點貴.....
 Hela 一般 DMEM

→ xxtomnyxx: Hela 也有 serum free 的 medium，你實驗室肯花錢就去
→ xxtomnyxx: 買來用用看，有另一個方法是可以用 centricon 把高分子
→ xxtomnyxx: 量的物質濾掉。
→ milkpa: 16-17KDa直接用30KDa篩掉濃縮就可以了
serum free對我來說不太可行 我的蛋白對serum敏感
有centricon這種東西阿...我來找找看
剛剛找researchgate時也有看到

推 lail: IP你的target protein?
我的抗體不能IP喔 (已試過

→ roy047: 上半部可以裁掉再下一抗...
這樣還是沒解決land會跑歪的問題吧@@

→ Ice9: 有 load FBS-only 的 lane 嗎？
你是說 100%FBS 直接Loading嗎
我是有直接下過沒養過細胞的medium  就...上方歪的更可怕

推 randolph80: 有跑普通的western確定過不是膠的問題嗎
確定 我跑lysate一切正常, 只有medium會出事
也有其他實驗用過3%BSA medium, 跑出來更可怕
※ 編輯: tynse71864 (140.109.32.9), 01/10/2016 19:45:35
→ Ice9: 等比例loading。但下東西以前可以稍微計算一下gel的允許量。
推 ko363630: 用centricon離心濃縮比較理想
推 randolph80: 膠的%數降低，電壓降低試試看