[求救] PCR突然做不出來

[s992003 (Lord of Ethanol)]

各位大大好
首po有不對的地方見諒
小弟之前有爬文看過pcr時有時無那篇
但好像沒有找到答案

小弟的pcr條件:
模板vector大小5.7kbp ，其中900多bp是我想放大的片段

primer F 長度26bp Tm70.6  GC73.1%
primer R 長度53bp Tm67.5  GC41.5%
模板濃度 0.5ng/ul
primer濃度 兩個都是0.25uM

PCR溫度
95度5分鐘
95度30秒, 60度30秒, 65度6分鐘 循環35次
65度7分鐘延長

最早之前在extension溫度68度 都做不出來
後來改成extension 65度的條件就p的出來

重點是
我大概2~3個月前換成extension 65度p出來之後，怎麼p都不會失敗

中間兩個月沒做pcr之後到現在，有一些原因要再回頭p，用一樣的條件怎麼p都是沒有任
何產物，就在電泳膠的最底下糊糊一小片而已

kit是用一模一樣的，而且新開的跟舊的都做不出來

模板vector DNA重新搖菌再抽過，新舊vector都p不出來

primer stock濃度100uM 溶劑為一般DDW，冰-20

有可能是primer當初沒有使用滅菌水配stock solution嗎



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.139.11.140
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1453123103.A.C67.html
→ IMR32: 建議你加一下3-5%DMSO
小弟不是專業的，想問DMSO在這邊的作用是?
→ blence: plasmid templateㄟ,以為隨便加就有了
→ blence: 一般來說extension 68度沒東西不是要提高溫度嗎,怎是降低?
但真的做得出來的時候，草率的加一樣都會出來，做了十幾次都沒失敗，
跟老師討論後是猜測68度超過我們primer的Tm值導致primer還沒來得及做就脫落了，
但結果似乎證實我們的假設正確，改低之後成功做出
→ jabari: ..嗯... 先來管新的primer  再跑一次gradient就知道了?
這實驗快放棄了XD可能不會買新primer
→ Ice9: 應該有Vecter上既有的primer可以當control吧？覺得是你引子
→ Ice9: 出差錯了。
會嘗試這個trouble shooting，謝謝!
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/19/2016 15:42:36
→ IMR32: 因為你的引子長度差太多，就在這周，學弟也是類似的問題
→ IMR32: 一樣是以plasmid當template，兩primer一長一短，低溫時產物
→ IMR32: 長度不對，高溫時，全部都是primer dimer
→ IMR32: 第三次就加3%DMSO+gradient，結果任何溫度都有出來
→ IMR32: 因此你的問題，我認為是長的那一條沒有解開所致，至於DMSO
這邊小弟不太懂,不是95度就幾乎完全展開,然後降溫之後互補的primer黏上,接著升溫開始延長
整個過程是在哪一個環節上,使較長的primer容易脫落之後能改善PCR結果呢?
→ IMR32: 你可以查詢dmso VS pcr，若實驗室有閒錢，也可用BETAINE
推 tynse71864: dmso會降低 Tm值 ，但會增加非專一辨識
→ huuban: 那通常PCR extension都在72度，primer怎麼不會掉?
小弟有點算跨領域實驗吧,很多細節都無法參透,但確實在降低extension溫度之後成功做出,
而且是可以重複的,似乎我們這個假設是正確的?
能在72度工作的primer是否Tm值或者GC%較高呢?
→ huuban: 為什麼你65度要6分鐘...這是哪支polymerase..我想認識
推 roy047: 900bp要做6分鐘真的超久orz
protocol給的標準溫度是68度,所以我們認為65度會降低反應速率,會需要更長的時間,
因為我們目的也只是要能重複做出來就好了,就先不改條件了,所以這個時間是沒有最佳化過的
→ WinnieDad: 可能誤以vector大小5.7kbp計算extension的時間吧？
→ xxtomnyxx: 可能是因為65不是polymerase最佳作用溫度所以才要那麼
→ xxtomnyxx: 久？
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 17:04:08
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 17:05:05
→ IMR32: 95是解開了，但回來72or68時，primer自黏比黏template高時
→ IMR32: 就會沒0.9k只會有一兩百b.p.的primer dimer，因此若是你發
→ IMR32: 現主產物是一兩百的話，建議你加DMSO，annealing tem.直接
→ IMR32: 72，elongation一分鐘即可，我建議你做看看，不到一小時半
→ IMR32: 就可確定
→ IMR32: 但我發現你短primer只有26，你有確定可黏上的部分有超過18?
了解了謝謝你,短primer的26個是完全互補,長primer則有30個完全互補
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:06:59
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:10:45
→ blence: 整個實驗條件修改的方式不合理
→ blence: 既然長primer只有30配對,Tm一定會更低,應該先降60而非68度
→ blence: 除了anneal可調整,一般extention設定在68~72其實不會動
→ blence: 會動extention主要是希望降低速度減少突變,而非增加anneal
→ blence: 除非實驗有特殊目的,不然應該捨棄現有條件,依照通用protoc
有想過primer可能黏不上,之前annealing溫度從40~65都試過,記得是都沒有產物所以去改
extension溫度看看,只是當時改條件之後突然一直都做得出來了,所以一直認為假設正確,
但實際情形可能要靠各位大大指教
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/20/2016 18:36:53
→ blence: 你們是以plasmid當template,Tm低一點也不用擔心雜band
了解!謝謝大家的意見,目前實驗結果是加了1%DMSO馬上就出現產物,但並不是非常專一,
我的目標大小是主要產物,但有較少量的雜band以及smear的情形,我會再調整條件看看
所以我之前的情形應該如IMR大大所說,傾向於primer自黏
※ 編輯: s992003 (36.237.23.151), 01/23/2016 14:20:30