→ Ice9: 抽了 plasmid 之後有做定序嗎？ 01/24 11:54
定序結果不理想,訊號雜亂,廠商再次嘗試之後表示無法成功定序
但抽出的質體明明很純,濃度也還OK有500ng/ul,我用insert的primer跟vector上的primer
都定不太好...囧,感覺我的vector變了
→ IMR32: 如果你是用傳統方法，用ligase以blunt end的方式黏進去 01/25 13:14
→ IMR32: 必須考慮合成的primer，5端無phospho group，必須kinase 01/25 13:15
→ IMR32: 處理過 01/25 13:15
→ IMR32: 另外，如同一樓，因為你只切一刀，還是以定序為準 01/25 13:16
我們當初有考慮blunt end會有太多副產物,所以用sticky end來接合
實驗結果是確定接出東西,大小符合,且含有抗生素耐性,也和空vector切一刀比對
排除了vector自接的假訊號
所以儘管定序方面不理想,老闆也認為接出來了,才叫我接著做
→ qasasasq: 這個實驗我做過如果有拿到正確的質體，我在heat shock後 01/26 10:09
→ qasasasq: 會放進37度的培養箱內4~5小時培養，促進Tn7幫助質體上的 01/26 10:11
→ qasasasq: insert進入bacmid中 01/26 10:12
→ qasasasq: 我碩班是學這個，有問題可以寄信給我 01/26 10:13
Protocol是說heat shock之後用SOC培養4小時,然後第一次失敗了之後我們培養6小時,部分塗盤
剩下的再加SOC繼續放大,濃縮之後再次塗盤,最後不管搖4小時還是6小時,或者之後放大的濃菌
都無法長出任何菌株,有懷疑我置盤跟過程有出錯,但用空vector做ctrl一次就成功
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/26/2016 15:43:08
推 jabari: b2b很賭運氣的 不過比b2blue好 01/26 15:29
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/26/2016 17:15:13
→ qasasasq: 你的培養盤上應該含有三種抗生素，理論上heat shock成功 01/27 09:06
→ qasasasq: 不管insert有沒有插入bacmid內都應該會長出菌，空載體在 01/27 09:09
→ qasasasq: 那個環境下是無法長出菌來 01/27 09:10
有三種抗生素,我看原文protocol的工作原理,應該是pFastbac1這個vector上的T7會夾一段
基因進去bacmid中,而原先pFastbac抗gentamicin的基因序列是反著的,無法抗gentamicin,但是夾入bacmid之後才能正常表達抗gentamicin的基因
原文protocol是說空的pFastbac1 vector在transform進去DH10bac之後,透過T7將一段DNA
夾進去(包含抗gentamicin基因),此時重組完的bacmid才能抗gentamicin,內容提到這是一
個positive control,因為我的vector跟原來vector相比就是多一段我外加的insert而已
具有抗生素耐性的基因還是在vector本身吧,所以空的vector應該要長?因為有轉入抗
gentamicin的基因,而且基因表達方向正確?
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/27/2016 16:32:16
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/27/2016 16:35:04
→ Ice9: 定序沒結果，那有再用PCR確認嗎？可以混用insert和vector上 01/27 20:00
→ Ice9: 的Primers搭配，另外再尋找其他適合切位做進一步確認。只切 01/27 20:00
→ Ice9: 一刀，而且是用vector上原有的切位，並不足以說明什麼。應該 01/27 20:02
→ Ice9: 再行確認你的序列完全沒問題再做下去。賭人品這種事，在科學 01/27 20:02
→ Ice9: 實驗上經常會得到負值。 01/27 20:03
→ Ice9: 這家不行換別家，primers可以再訂新的或確認其他因子沒問題. 01/27 20:05
定序做了一些嘗試都不太行,不是沒訊號就是訊號雜亂,無論從insert端還是vector上,
切一刀的用意不是確定切位,是想讓vector呈線性然後就可以看到正確的分子量大小,因為
supercoil很難看出正確大小
但小弟現在比較不解的是,好就算我放進去的insert是錯的,但我的產物跟原始vector一樣
能抵抗amp,所以vector的序列應該沒錯才對,就只是在切點中插入一段未知的序列,它該有
的vector功能還是應該要存在
畢竟我就是拿那個純的vector切兩刀然後純化在去跟切兩刀的insert進行ligation,
就算我做成vector自接,它也是要具備vector的功能,能轉入bacmid中才對
奇怪的是我就從那個膠切出來怎麼會跑出一個分子量一樣大的vector然後能跟原來vector
一樣能抗其中一種抗生素,但其他部分的基因好像完全不一樣似的,這假訊號也太巧了吧..
除非接進去的insert上的基因能表達出一些東西破壞其他基因的正常表現...
其實insert在接進去前有定序一次,正確無誤就是了
推 jabari: b2b需要同源重組啦 養菌的timing很難抓 有時候放久一點會 01/28 05:34
→ jabari: 中 有時候放久會變弱勢 碰運氣吧 01/28 05:34
推 jabari: 再來就是你的DH10bac是自己再作的還是買i牌貴鬆鬆的 那隻 01/28 05:38
→ jabari: 自製的效果很不好 01/28 05:38
是用i牌貴鬆鬆的,所以前面兩三次沒做出來,老闆就叫我不要做太多嘗試,先找出錯的地方
但用沒接進insert的vector一次就成功...如果接進insert也才多900多bp,轉入bacmid的
效率應該不會因為這900多bp而差太多吧
→ qasasasq: gentamicin 只是確認自己的質體是否有成功進入DH10bac 01/28 09:25
→ qasasasq: 本身DH10bac就應該有Kanamycin和tetracyclin抗生素耐性 01/28 09:28
→ qasasasq: 所以當質體有進去DH10bac中時，有沒有進行基因的轉移都 01/28 09:30
→ qasasasq: 具有三種抗生素的抗性，判斷基因是否插入bacmid中用藍白 01/28 09:32
→ qasasasq: 篩來做判定 01/28 09:33
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 01/28/2016 16:09:41
推 jabari: 嗯... 看來只能試了 0.,0 DH10bac超貴的 我都減量try 02/01 20:51
→ VincentYan: 定序的總量200-300 ng就可以，你的plasmid濃度500 ng/ 06/06 16:27
→ VincentYan: uL太高了... 06/06 16:27