[求救] PCR達人請教 一段怎麼p都p不出來的區域

[sylvialalala (sylvia)]

想請教ＰＣＲ達人  有關一段怎麼Ｐ都Ｐ不出來的genome區域(昆蟲)

我之前從沒遇過這樣的問題....已經不知道如何解了

圖示primer設計

A_F   B_F  B_R   A_R

B這段區域約300 bp  是可以成功的

有問題的是A這個區域  約1500 bp

怎麼p都p不出來 （前後已經設計10對primer  交叉互p也都不行）

只有一對有微弱的band  但是不是每個sample都有

試過的條件： TM: primer tm約50~52  每個溫度都有試過 (目前頃向再跑gradient)

mgcl2  2mM （雖然也可以跑gradient 但因為連band都沒有我覺得應該無效）

雖然gc約只有33%  但有試過final 1mM betaine  無效

A_F/B_R  或是B_F/A_R 也失敗  (這裏的A有大概五對primer在試)

請教達人我還可以怎麼試呢？

有增加dna template到2ul 但還是沒改善  (有用positive確認過dna ok)

謝謝！


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 72.89.115.239
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1453949096.A.DB7.html
推 micocat: 用Taq批看看?! betaine應該是對 GC rich有幫助
目前是用invitrogen的amplitaq  也有換過master mix or kapa的taq  還是無法p
→ hitmd: 用哪一支polymerase?
invitrogen的amplitaq                 01/28 13:07
→ xxtomnyxx: 1. 加 DMSO 3~10%
已試過betaine  或是dmso跟betaine作用不一樣？
→ xxtomnyxx: 2. 增加 denature and/or annealing 的溫度和時間；
有試過各種annealing了  但denature的溫度與時間不同會有幫助？
→ xxtomnyxx: 3. 降低 template DNA 的量；
有試過1, 2ul  但似乎dna越多p的band越明顯一點
→ xxtomnyxx: 4. 增加 initial denature 的時間
→ xxtomnyxx: 5. 換 Phusion polymerase
這就要另外買了.....

→ xxtomnyxx: 另外，你確定你手上的昆蟲 genome 序列是完整正確的？
確認是正確的
推 jabari: roche probemaster... 不過是dUTP.  囧b
→ Ice9: construct用嗎？為什麼要那麼長？還有不同sample? 另外，GC
→ Ice9: content有時並不一定要看目標產物的全長。某一段內有密集出
→ Ice9: 現到70-80%以上，甚至是primer附近就有一小段時也要考慮進去
→ Ice9: 還有，大的做不了，分成兩三段再接合也是可以想一想的。
→ Ice9: 若是做類似鑑種比對，試過degenerate primers嗎？或是像在做
→ Ice9: RACE PCR 一樣的方法做設計？
兩三段接合也是無法p (aF/bR bF/aR p不出)
不是鑑種   是要看mutation有無成功
degenerate primer??可以麻煩說詳細一點嗎？

今天try增加到80 cycle (40+40) 還有annealing 跑gradient試試
※ 編輯: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:09:07
※ 編輯: sylvialalala (129.85.224.239), 01/29/2016 02:10:14
→ Ice9: 如果不是鑑種，而是針對已知序列中的某一段做確認，那就不需
→ Ice9: 要degenerate primer了。  然後，你是哪種 mutation？
→ Ice9: 呃，抱歉，我是想問你做的研究是想分析哪種 mutation?
推 micocat: betaine內文提到是加1mM，不知道是不是筆誤，建議加1M
→ micocat: 另外genomic DNA denature建議設高一點，98℃或96℃
→ micocat: 不過taq可能稱不太住，調高溫度的話taq可能要加量
→ micocat: 另外，要確認有沒有突變怎麼不是用proofreading enzyme?
推 ookubo: extension時間?
推 jabari: 有時侯就是P不了 建議原po去查看看有沒有其他資料庫ngs的
→ jabari: 結果 我前幾年也遇到怎樣也p不到 丟ngs回來coverage超差
→ jabari:  然後insel沒人有定論的片段 .... gDNA不行就換從rna下手
→ jabari: 吧 囧
→ satasumi: PRIMER...多長?