[求救] Flow cytometry protocol(FITC)

[tony51501 (x-ray)]

各位大大好

小弟第一次接觸FLOW

使用的機器是BD FACSCalibur Flow Cytometry

想做經過我transfect基因後 想看細胞表面的抗原表現



有幾個想請教大家

上機之前細胞的處理

1.blocking方面大家是如何做的

我們實驗室之前學姊protocol是寫0.5 BSA/PBS 1hr

可是上網爬文,許多人好像都是用酒精?


2.一抗和二抗

我知道有直接下一次抗體(帶有FITC or PE)就可以上機的抗體

可是我做的blood group好像沒有可以直接下一次抗體

所以我是下完一抗1hr 0.5%BSA/PBS washX3 在下二抗帶有FITC(確定沒有加錯二抗)


3.FLOW機器的操作

做三次每次的X-FSC Y-SSC的圖都不是像大家的微笑曲線

然後X-FITC Y-Count 的圖 peak都沒shift(positive ctrl)

而且跑WB 是確定有transfect gene進去的



希望版上大大能幫解惑~~


感謝


補圖

http://imgur.com/TxcZ7OV.jpg

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.72.94
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1457692814.A.E10.html
→ saviora: 有圖可看嗎
我人在外面，晚點回去補圖
※ 編輯: tony51501 (27.247.22.65), 03/11/2016 20:21:41
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:02:30
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:09:48
推 qiet: 1. blocking用酒精?你一定是誤會了什麼事情
→ qiet: 2. 就操作來說沒問題
→ qiet: 3. 你的細胞是不是死一堆不健康還是一堆碎片阿?
我收細胞是用trypsin->PBS wash->0.5%BSA blocking
之後都放冰上而且離心機也都調4度C(1500rpm 5min)
我有問其他實驗室學姊他也說我的細胞狀況很差
我也不知道為什麼死那麼多QQ

→ qiet: 另外能跑western blot的抗體不一定能用來看flow
→ qiet: 一個是看denature protein一個是有3/4級結構的阿
我們老闆買的一抗 http://www.biolegend.com/anti-bg-4-antibody-11016.html
這種一抗需要避光嗎?

推 lraruku: 建議你可以從原廠的操作步驟開始研究，之後修正你的操作
→ lraruku: 步驟
推 lraruku: 可參考這個http://goo.gl/L8yEbw
已閱!!感謝

推 ssds: 通常初學有人帶吧 問學長姐比較快
推 qiet: 冏, 原來是血型...
有人帶~~只是在上機後的資料判讀帶的人不太會QQ
我也是去查很多資料像是'mark' 'gate' 'mean' 'geo mean'需要看哪個以及代表的意義

推 jabari: no-gate.... 先把ssc/fsc 左下角的渣渣們去掉
推 tz2733: WB跟flow是看同一個蛋白質嗎?確認有送進去跟你細胞有改變(
→ tz2733: flow要看的表面抗原有表現)可能會是兩件事喔~
不知道什麼樣的gate才是最好的,是gate微笑曲線嗎?
WB我是壓帶有tag的plasmid,flow則是抓細胞表面的antigen,希望我的一抗是有work的
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 11:54:23
推 conective: 一抗是ihc的 不代表可以做FLOW唷
→ conective: 看起來是沒有螢光表現
好的,我也正想跟我們老闆討論看看!!
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 13:34:58
推 tz2733: gate是要找你主要細胞群圈選出來 你fsc跟ssc上機時要不要
→ tz2733: 調小一點 因為點圖右邊那群被切一半的細胞會不會才是你要
→ tz2733: 看的細胞??
已經調最小了欸QQ，還是要把電壓調E-00我忘記是什麼可是好像可以縮小觀察細胞

推 qiet: 應該還是找的到flow能用的抗體, 另外也許要是有個對照組
→ qiet: 應該可以幫助找到條件...抽點血之類的XDD
→ qiet: eBioscience有同樣的clone有加螢光但一樣沒說是否Flow可做
好的，我再找找試試看

推 Cheinder: 感覺有大部分沒染到 可以了解一下在螢光0以下的細胞比例
→ Cheinder: 來檢視染色效果  若不佳 可換二抗看看  在換一抗試試
嗯嗯，那要花一些時間test了！
※ 編輯: tony51501 (27.247.6.19), 03/13/2016 23:11:44
推 jabari: 你先試run個PI stain. 抓到感覺再跑你的sample
→ jabari: btw 要看表現 直接細胞染色看IFA會不會簡單點
好的，我查查看或問人怎麼做好了！謝謝你
對了，染P I不是看cell cycle的狀況嗎？然後我現在做應該就是indirect吧？

推 tz2733: 如果你現在是用E01 數值也無法再調小  那要變小的確是改
→ tz2733: 成E00沒錯 然後再調整數值至欲觀察細胞群"位在畫面中間且
→ tz2733: 成群"  加油~
我好像是用E00，有試過改成E-1，調整以後可以像微笑曲線，這樣不知道可不可以，謝謝
你！
※ 編輯: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 14:50:43
※ 編輯: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 15:23:10
推 conective: 重點是有看到細胞 電壓值跟你細胞大小有關 沒有標準答
→ conective: 案
→ conective: 你有沒有Positive control 就是必定會染上的組別?
有做但是效果好像沒有很好，我再想是不是我細胞的問題，可是繼代存活率有96%說Q Q
※ 編輯: tony51501 (27.246.200.215), 03/15/2016 15:29:16
→ a90648: 連positive control都很弱怎麼會懷疑是細胞問題?
因為我沒有圈gata，細胞累積圖整個很分散，死細胞無法bind到抗體，因此分母變大很多
，分子不變，所以pick看起來就好像沒有shift
※ 編輯: tony51501 (27.247.39.155), 03/15/2016 23:46:11
→ a90648: 有訊號即使%還是會看到shift
→ a90648: %"少" 漏字，你的圖看起來比較像是沒訊號不是%少
我positive的圖沒有放上來，是有shift一點但不明顯
※ 編輯: tony51501 (39.12.90.126), 03/17/2016 09:52:56