[求救] 解決置換buffer而蛋白沉澱

[bill00202000 (handsome)]

我的目標蛋白是從大腸桿菌破菌得到，藉由NI-NTA純化，最後用elution(50mM NaH2PO4,

300mM NaCl,250mM imidazole,pH 4)洗出蛋白，因為最後要置換成PBS(pH 4)，所以

elution直接調成pH4而不是8，我的PBS是以50mM NaH2PO4 + 150mM NaCl與50mM H3PO4

 + 150mM NaCl互相調至pH 4，那是以濃縮管進行至換，可是置換後蛋白會有白色沉澱出

來，所以想請問大家由何種方法可以解決，我後續要用pH 4環境作用，ph無法辨更，

感謝大家的解答

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→ blence: 好奇一問,PBS如其pH buffer功能,如何調到pH=4?
→ Ice9: 這個應該是指一般的PB solution而不是saline。我猜可能是pH
→ Ice9: 變化太快？能用pH梯度緩緩替換嗎？pH 8 --> pH 4。
→ Ice9: 還有你的目標蛋白需要金屬離子來構形的話，可能也會有些問題
→ Ice9: 另外，有時候換換 His-tag 的位置會有不同效果。
推 jabari: 算PI... 不行就去找PI
elution已經用pH 4來洗出蛋白，我再置換pH應該不會變化太大?
蛋白pI是5.23
※ 編輯: bill00202000 (140.120.104.80), 04/16/2016 20:04:36
※ 編輯: bill00202000 (140.120.104.80), 04/16/2016 20:06:04
→ kg9101266: 改成透析膜看看，有的蛋白對鹽濃度敏感，也可考慮+DTT
→ kg9101266: 透析膜O/N緩速置換溶液
推 july81212: pH4 PB的緩衝不好看要不要換其他buffer
→ july81212: 比較穩定
推 Ianthegood: 如果mwco許可dialysis應該是最安全 不然centricon濃縮
→ Ianthegood: 稀釋循環也可以 比較費工一點就是了
推 Ianthegood: 忽然想到 如果透析8->4 經過pI 蛋白會不會掉出來啊
推 jabari: 5.3差一個pH log 可能不夠力 試試正常3.0~3.5 elute再滴回
→ jabari: 4看看?  真的不行的話改回imidazol試試?